喹诺酮类药物耐药机制研究进展

李 超，王明琼，赵永攀，魏淑娟，董 强

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵 712100;2.西藏错那县农牧综合服务中心，西藏错那 856700;3.西藏乃东区农牧综合服务中心，西藏乃东 856100;4.陕西省畜牧产业试验示范中心，陕西泾阳 713700)

抗菌药在细菌性感染导致的人类和动物疾病预防和治疗中起着无可替代的作用。然而随着抗菌药的不合理使用，尤其是在畜牧业生产和水产养殖方面的滥用，推动了耐药细菌的出现和传播，增加了畜禽的发病率、死亡率和治疗费用。对抗菌药具有耐药性的菌株，特别是多重耐药菌株的传播，严重威胁公共卫生安全。喹诺酮类抗菌药物已成为继头孢菌素类抗菌药物之后抗感染治疗应用最为广泛的抗菌药物，因此其耐药性问题备受关注。喹诺酮类抗菌药作为一种新型的抗菌药，一直被用作开发具有广谱生物活性的新型半合成或合成药物[1-2]。随着喹诺酮类及其衍生物在临床上的使用，喹诺酮类耐药菌株逐渐出现并增多，内蒙古包头地区个别医院临床分离的大肠埃希氏菌株对喹诺酮的耐药率达79%[3]。质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnr、aac(6′)-Ib-cr、qepA等可在不同种属细菌间水平传播。本文对喹诺酮类耐药机制和质粒介导的喹诺酮类抗菌药耐药基因传播机制进行综述，以期为相关科研和工作人员提供参考。

1 染色体介导的喹诺酮类药物耐药机制

1.1 DNA回旋酶和DNA拓扑异构酶Ⅳ突变

DNA回旋酶和DNA拓扑异构酶Ⅳ在喹诺酮类药物耐药决定区的突变是染色体介导喹诺酮类耐药的最常见也是最重要的原因之一。喹诺酮类药物耐药决定区域位于大肠埃希氏菌编码DNA回旋酶GyrA亚基基因的67-106位氨基酸，GyrB亚基基因的426-447位氨基酸之间；编码DNA拓扑异构酶Ⅳ ParC亚基基因的63-102位氨基酸，ParE亚基基因420-441位氨基酸之间[4]。DNA回旋酶和DNA拓扑异构酶Ⅳ中任何一种亚基的单个氨基酸发生突变都会削弱喹诺酮类药物与酶之间的相互作用，增加细菌对喹诺酮类药物的耐药性，最常见的两种突变位于Asp 426 Asn和Lys 447 Glu (大肠埃希氏菌编号)[4]。喹诺酮类药物耐药决定区突变主要位于GyrA亚基和ParC亚基的氨基酸末端，较少位于GyrB亚基和ParE亚基的氨基酸末端[5]。环丙沙星耐药菌株主要通过水-金属离子桥与喹诺酮类药物发生特异性相互作用，故其最常见的突变残基是GyrA/ParC亚基上的Ser和Asp/Glu[6]。对氟甲喹耐药分离株中GyrA发生染色体突变的情况较为少见，而GyrB的突变发生率较高[7]。也有报道称金黄色葡萄球菌中parC(Ser 80 Tyr和Glu 84 Lys/Gly)和gyrA(Ser 84 Leu和/或Glu 88 Lys)的多点突变，导致莫西沙星和环丙沙星的最小抑制浓度(MIC)比单点突变升高了4倍～16倍[8]，证明多点突变比单点突变更易产生耐药性。

1.2 AcrAB-TolC外排泵

喹诺酮类药物可通过革兰氏阴性菌外膜的孔蛋白途径扩散进入细胞，从而发挥抑菌作用。细菌孔蛋白的丢失、下调、通道大小和表达的改变均可减少或阻止抗菌素流入细胞，导致细菌产生耐药性。AcrAB是革兰氏阴性菌中广泛存在的质子/药物反转运蛋白外排泵。在肠杆菌科中，AcrAB-TolC多耐药外排泵是临床最重要的外排系统，由内膜转运蛋白(AcrB)、膜融合蛋白(AcrA)和外膜蛋白通道(TolC)三部分组成，属于抗药结节化细胞分化家族(RND)[4]。通过cryo-ET原位膜蛋白结构检测发现，在AcrAB-TolC完全组装泵中TolC∶AcrA∶AcrB的原位比例为3∶6∶3，且部分颗粒中可能不存在TolC，证明TolC可能并非AcrAB-TolC的必要组成部分[9]。耐药试验表明，AcrAB-TolC泵过表达的菌株比野生型菌株具有更高的MIC[9]。在细胞环境中，AcrA的N-端锚定在内膜上，α-发夹与肽聚糖接触，在AcrB和TolC之间传递，从而调节泵的关闭和打开[9]。不同的调控基因(如acrR、marA、rob和soxS)均可调控AcrAB-TolC泵的过表达，从而减少喹诺酮类药物的摄取，增加其排出，且OmpF、OmpC、OmpD、OmpA和OmpX孔蛋白表达的改变，可升高喹诺酮类药物的MIC[10]。对117株肺炎克雷伯菌进行耐药基因检测分析，21%的分离菌株中AcrAB泵的表达量显著增加[11]。外排泵介导喹诺酮类耐药或敏感性降低的细菌分离株占比高达75%[7]，从而推测主动外排介导的耐药性为细菌产生耐药的主要机制。

1.3 NorA外排泵

NorA是由norA基因编码的388个氨基酸组成的单肽跨膜蛋白，其C-端和N-端结构域分别由6个α螺旋跨膜段组成，呈伪双对称排列，属于主要促进家族，是金黄色葡萄球菌中研究最为广泛的多耐药外排泵[12]。NorA被归类为药物/H+逆向转运体，其过表达可导致喹诺酮类药物的大量排出。不同的norA启动子突变可引起基因表达增加，导致细菌对亲水氟喹诺酮类药物和防腐剂的耐受性增加[13]。NorA只转运亲水性较强的喹诺酮类药物(如诺氟沙星和环丙沙星)，而NorB和NorC转运诺氟沙星、环丙沙星和亲水性较弱的化合物(如莫西沙星和左氧氟沙星)[2]。norA基因的过表达不仅可以直接使环丙沙星和诺氟沙星的MIC分别提高5倍和40倍[14]，还可促进金黄色葡萄球菌对环丙沙星耐药性的进化[15]，证明norA基因不仅可以引起细菌产生耐药性，还可促进细菌耐药性的突变，其是否对其他耐药基因的突变具有促进作用，值得进一步关注。

2 质粒介导的喹诺酮类耐药机制

2.1 qnr基因

第1个质粒介导的喹诺酮类耐药基因被命名为qnrA，随后其相关耐药基因qnrB、qnrC、qnrD和qnrS等也被相继发现。QnrA作为第1个被鉴定的Qnr蛋白，其蛋白结构和耐药机制也被研究得较为清楚。因QnrA能够编码五肽重复序列蛋白，其被归类于五肽重复蛋白家族。最初被发现可保护大肠埃希氏菌的DNA回旋酶免受抗菌肽Microcin B17的影响，从而对抗其他竞争性细菌的威胁[2]。抗菌肽Microcin B17作为肠杆菌科产生的天然抗菌肽毒素，可在不破坏细菌细胞膜完整性的情况下进入胞内，抑制DNA和RNA合成从而抑制细菌的生长繁殖[16]。随着对保护分子机制研究的深入，发现具有类似DNA的3D结构和β螺旋结构，可与DNA依赖酶竞争性结合，从抑制喹诺酮类药物与细菌的结合。当DNA回旋酶与DNA结合时，Qnr可特异性地与回旋酶及GyrA和GyrB结合，从而降低促旋酶与DNA的结合能力[17]，但Qnr与回旋酶的结合位点不同于DNA结合位点。Qnr蛋白主要通过减低药物-回旋酶-DNA复合体的浓度，从而减弱喹诺酮药物的抑菌能力，产生耐药性[18]。此外，喹诺酮类药物作为细菌SOS应答的有效诱导剂，尤其是亚致死浓度的喹诺酮药物能直接上调Qnr蛋白的表达，降低喹诺酮类药物与DNA回旋酶的结合能力，并增加细菌基因的突变率和非同源重组[2]。研究发现[19]，39株耐药菌株中，qnrD、qnrS和aac(6′)-Ib-cr耐药基因的菌株分别为79.5%，79.5%和71.8%，推测其产生耐药性的主要机制为qnrD、qnrS和aac(6′)-Ib-cr介导。

2.2 aac(6′)-Ib-cr基因

AAC(6′)-Ib是一种氨基糖苷乙酰基团转移酶，其变异基因aac(6′)-Ib-cr常见的2个突变位点为Trp 102 Arg和Asp 179 Tyr，可同时作用于氨基糖苷类和氟喹诺酮类两类结构不同的抗菌药物[17]。aac(6′)-Ib-cr可使含有未取代哌嗪基的喹诺酮类药物的氨基氮发生乙酰化，从而降低喹诺酮与靶酶的结合性，发挥耐药作用(如环丙沙星和诺氟沙星)，但不包括其他喹诺酮类如左氧氟沙星和莫西沙星[17]。此外，AAC(6′)-Ib-cr的N-端包含12种独特的氨基酸，不同的突变位点导致不同的喹诺酮类药物耐药。有研究检测到AAC(6′)-Ib-cr的变异体能够乙酰化吉米沙星和氧氟沙星，但其突变点为Asp 179 Tyr和Ser 117 Leu，却没有Trp 102 Arg，表明微小的氨基酸改变可导致耐药性的差异[20]。因此，对AAC(6′)-Ib-cr进行检测对比可能会对目前喹诺酮类耐药机制有新的认知。

2.3 crpP基因

crpP基因是在铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)携带的结合质粒pUM505中发现的一个新的质粒介导喹诺酮类耐药基因，可导致铜绿假单胞菌对环丙沙星产生耐药性，并使大肠埃希氏菌对环丙沙星MIC提高7.5倍[10]。环丙沙星耐药蛋白(ciprofloxacin resistance protein,CrpP)由65个氨基酸组成，与耻垢分支杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的氨基糖苷磷酸转移酶具有40%的氨基酸同源性，并含有氨基糖苷磷酸转移酶的2个保守催化残基[8]。氨基糖苷磷酸转移酶作为细菌产生一种磷酸转移酶，可作用于氨基糖的特定羟基，使其磷酸化从而使氨基糖苷失活的酶。CrpP可通过ATP依赖机制磷酸化环丙沙星，导致抗生素降解，从而导致细菌对环丙沙星产生特异性耐药性[21]。因crpP基因发现较晚，其机制研究尚不太明确，根据现有研究推测，其可能通过修饰喹诺酮类药物的羧基与ATP结合，导致喹诺酮类药物磷酸化和降解，以改变底物激活或抑制作用，最终引起药物活性水平的改变。同时，有推测crpP的起源可能与植物相关的假单胞菌科有关[17]。

2.4 QepA外排泵

qepA耐药基因是在大肠埃希氏菌C316质粒pHPA中发现的新的喹诺酮类耐药基因，其可编码QepA外排泵(quinolone efflux pump,QepA)，从而将一些氟喹诺酮类药物从细胞质转运到细菌内膜外[22]。qepA基因被认为是从某些环境微生物中外源获得，且常常和rmtB基因在同一个质粒上[22]。QepA蛋白是主要促进家族中的一种质粒介导的质子依赖性外排泵，可降低亲水氟喹诺酮类药物的敏感性，特别是环丙沙星和诺氟沙星，但无法泵出疏水性喹诺酮类和非喹诺酮类药物[17]。通过对鸡胴体拭子和解冻液进行检测分析，质粒介导的氟喹诺酮耐药基因主要为qepA(22.2%)，且分离株对环丙沙星耐药性为70%[23]。

2.5 OqxAB外排泵

OqxAB外排泵属于RND外排系统，由膜融合蛋白OqxA和内膜转运蛋白OqxB组成，是RND家族中第一个由质粒介导的外排泵[24]。许多质粒复制子(包括IncF、IncH、IncI、IncHI2和IncX)都能转移oqxAB基因，导致oqxAB在多种细菌中水平传播。此外，通过基因杂交技术，在克雷伯菌和拉乌尔氏菌中发现其染色体携带有oqxAB，并与质粒oqxAB存在高度同源性[24]。但是将oqxAB基因从染色体转位到质粒上，可使oqxAB外排泵表达量增加80倍以上，从而导致多耐药性表型[24]。OqxAB外排泵不仅可以介导喹诺酮类耐药，而且在低浓度喹诺酮类药物下，可促进细菌高水平耐药相关的拓扑异构酶发生突变。研究发现，同属于RND家族的TMexCD1-TOprJ1外排泵也可增加细菌对喹诺酮的耐药性[25]。

3 展望

耐药性基因将长期持续与人类和动物共存。为了解决喹诺酮类药物的耐药性，尤其是多耐药性表型细菌，必须在世界范围内遵循抗生素合理的使用指南，以控制耐药性细菌的持续产生和传播。