siRNA抑制牛睾丸细胞Nrf2基因表达的研究

胡修忠，向敏，余婕，刘辰晖，夏瑜，陶弼菲，周源，王定发，程蕾

（武汉市农业科学院畜牧兽医科学研究所，武汉 430208）

热应激是指机体在高温条件下对热暴露所做出的非特异性生理反应的总和[1]。公牛睾丸温度比体温低2～6℃，这对于产生形态正常、有活力和可育的精子至关重要[2]。高温可引起睾丸组织氧化应激，导致生精上皮细胞凋亡和死亡，精子活力和密度降低[3]。当睾丸温度升高到38℃以上时，睾丸的生精机能受到损害，造成畸形精子和死亡精子数量增多，精子质量严重下降[4]。高温热应激所致的精液品质下降需经7～9周才能恢复正常[3]。

核因子E2相关因子（nuclear factor E2 related factor，Nrf2）是氧化应激表达的一种关键转录因子，通过抗氧化反应原件（antioxidant responsive element，ARE）调节下游靶基因完成抗氧化、保护机体的功能，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗衰老、抗细胞损伤、保护生育等作用[5]。研究表明，精子活力降低的男性精子中的Nrf2基因mRNA表达水平往往较低[6]，而Nrf2启动子区单核苷酸多态性与Nrf2表达降低相关，并导致少、弱精子症[7]。Nrf2基因敲除小鼠睾丸组织氧化应激增加，细胞凋亡增加，精子数量显著降低，但血清睾酮水平没有发生变化[8]。抗氧化剂（N-乙酰半胱氨酸）可以提高少、弱精子症患者Nrf2基因表达和抗氧化酶水平，显著增加精子密度和活力，而异常形态精子和DNA断裂率显著降低[9]。基于此，本次试验通过下调体外培养牛睾丸细胞中Nrf2的表达，研究Nrf2对牛睾丸细胞的增殖、抗氧化基因表达的影响，探索Nrf2蛋白在牛睾丸细胞中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

RNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit）、反转录试剂盒（primeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser），购自Takara公司；荧光定量试剂盒（SYBR® Green Realtime PCR Master Mix），购自TOYOBO公司；Lipofectamine®3000，购自Invitrogen公司；CCK-8，购自Solarbio公司；DMEM/F12培养基，购自Hyclone公司；胎牛血清，购自Gibco公司；抗体，购自Proteintech公司。

1.2 睾丸细胞的分离和培养

睾丸细胞的分离和培养采用文献建立的方法[10]。取出睾丸，剥去睾丸白膜及血管，剪碎转入一个装有玻璃珠并经高温灭菌处理的抽滤瓶中，继续向抽滤瓶中加入细胞消化液直至浸没全部玻璃珠及放置的睾丸组织，放置于37℃水浴锅中消化30min。在超净工作台内慢慢将消化液倒出，再向瓶中加入DMEM/F12工作液进行中和，倒去培养基，强烈振摇，使消化后的睾丸细胞充分从组织块上分离出来，再用培养基冲洗玻璃珠，洗液即成为细胞悬液，倒入细胞瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

1.3 siRNA合成

根据GeneBank中查得Nrf2基因（登录号：NM_001011678.2）的全基因序列，根据siRNA基本设计原则设计，由上海英骏生物科技有限公司合成靶向Nrf2基因的siRNA（siRNA-1672表示）（表1）。

表1 siRNA序列

1.4 瞬时转染

接种牛睾丸细胞1×105个/孔于6孔板中，当细胞生长至70%融合度时进行转染，具体操作参照Invitrogen公司Lipofectamine 3000试剂盒说明书进行。试验分组：对照组和转染NRF2特异性siRNA试验组(试验组)。转染24～72h后用于基因表达检测、蛋白表达和细胞生物学实验。

1.5 实时荧光定量PCR检测转染后对基因mRNA表达的影响

1.5.1 引物设计

根据GenBank中牛Nrf2基因mRNA（登录号：NM_001011678.2）、HO-1基因mRNA（登录号：NM_001014912.1）、NQO1基因mRNA（登录号：NM_001034535.1）和β-Actin基因mRNA（登录号：AY141970.1）序列，利用Primer premier 5.0软件设计引物，引物序列及产物大小见表2。引物由武汉擎科生物技术有限公司合成，用灭菌三蒸水溶解稀释成10μmol/L，-20℃保存。

表2 引物序列

1.5.2 总RNA的提取及反转录

按照RNA提取试剂盒说明书提取各处理组细胞中的总RNA，测定RNA浓度及纯度。按反转录试剂盒说明方法反转录成cDNA。

1.5.3 实时定量PCR

以反转录所得cDNA为模板，利用BIO-RAD IQ5实时定量PCR仪进行试验，PCR反应体系：SYBR GREEN 12.5μL，上下游引物各0.75μL，模板RNA 2μL，ddH2O 9μL。反应参数：94℃预变性10s，94℃变性5s，60℃ 10s，40个循环，循环结束后获得熔解曲线。

1.5.4 Western boltting检测

取不同处理组培养的牛睾丸细胞，分别提取总蛋白，采用BCA法测蛋白浓度，依此调整上样量，100V电泳转移到PVDF膜上，封闭后加入兔抗人多克隆抗体（1:500），4℃过夜，二抗孵育1h；用小鼠抗β-Actin单克隆抗体作为内参。用Thermo ECL试剂盒进行底物显色，操作按照说明书，显影、定影、冲洗胶片、扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

1.5.5 CCK-8检测细胞增殖

收集转染24h后及未转染的细胞，制备成单细胞悬液。以5×103个/孔接种于96孔培养板，每孔100μL，并设置5个复孔。继续培养细胞1、2、3、4、5d后，向每孔加入10μ L CCK-8溶液于37℃培养1h，然后用酶标仪检测450nm的吸光度。

2 结果与分析

2.1 原代细胞体外培养形态及特点

经培养12h后，细胞贴壁良好，部分细胞已开始拉伸变长。细胞呈成纤维细胞样生长，当细胞长满单层时透光性好，见图1。

图1 牛原代睾丸细胞光镜照片（X100）

2.2 siRNA对细胞Nrf2基因mRNA表达的影响

通过RT-PCR检测siRNA-1672转染牛睾丸细胞24h后Nrf2 mRNA表达水平。试验检测了终浓度为50nmol/L时对牛睾丸细胞Nrf2基因mRNA表达水平的影响。结果显示试验组中转染siRNA-1672的Nrf2基因mRNA表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，图2），提示试验组中Nrf2基因被有效沉默。终浓度为50nmol/L时具有较好干扰效果，后续试验处理浓度均为该浓度。

图2 siRNA-1672处理细胞24h后Nrf2基因mRNA的相对表达量

2.3 siRNA干扰对Nrf2基因在蛋白质水平的影响

通过Western boltting及灰度值分析，检测了Nrf2基因被干扰72h后Nrf2蛋白质表达量的变化，结果见图3。siRNA-1672干扰72h后Nrf2蛋白质表达明显下降，与对照组差异达到显著水平（P＜0.05）。

图3 细胞中Nrf2表达情况

2.4 siRNA对细胞增殖的影响

cck-8法检测发现，经siRNA-1672作用后的试验组细胞增殖能力明显减弱，4d后两组细胞增殖能力均开始减弱。试验组与对照组之间存在差异（图4）。

图4 siRNA对细胞增殖的影响

2.5 siRNA干扰对HO-1和NQO1基因mRNA表达的影响

siRNA-1672转染牛睾丸细胞24h后HO-1和NQO1基因mRNA表达情况见图5。从图中可以看出HO-1和NQO1基因mRNA表达明显降低，HO-1基因的mRNA表达量约为对照组的60%（图5A），NQO1基因的mRNA表达量低于对照组的80%（图5B）。因此，随着Nrf2基因表达被抑制，HO-1和NQO1基因的表达量也随之降低。

图5 siRNA处理细胞24h后HO-1和NQO1基因mRNA的相对表达量

2.6 siRNA干扰对HO-1和NQO1基因蛋白表达水平的影响

通过Western blot法分别检测siRNA-1672转染牛睾丸细胞72h后HO-1和NQO1基因的蛋白相对表达水平，结果见图6。结果显示在Nrf2基因被有效沉默后，HO-1基因和NQO1基因的蛋白表达明显下降。

图6 HO-1和NQO1蛋白质表达检测

3 讨论

Nrf2是调控细胞氧化应激反应的重要转录因子，在抗氧化应激中起到关键作用，通过诱导调控一系列基因的表达，使细胞处于稳定状态，维持机体氧化还原动态平衡。目前，多达上百种的基因被认为跟Nrf2的调控相关，其中很多都是氧化还原敏感的转录因子[11]。热应激对雄性生殖影响的研究发现，Nrf2抗氧化信号通路被激活以抵抗环境高温应激，降低睾丸细胞和睾丸支持细胞的凋亡[12,13]。而且Nrf2能降低重金属对雄性生殖细胞的氧化应激损伤[14]。此外，Nrf2基因缺失也会导致睾丸和附睾氧化应激，从而干扰精子发生、降低生育能力；而且随着年龄的增长，生精小管损伤不断累积[15]，生育能力进一步下降。Nrf2基因缺失也会导致胎盘功能降低，氧化应激水平增加，胎儿体重明显降低[16]。随着Nrf2功能的深度挖掘，其在生殖上面的作用也被重视起来。

HO-1和NQO1均是受Nrf2调控的下游基因，HO-1具有抗炎、抗细胞凋亡、抗氧化和抗增殖作用，在许多条件下起到保护作用。HO-1酶是Nrf2的主要靶点之一，也是Nrf2依赖的细胞对氧化应激和外源性物质反应的主要效应物[17]。当环境高温或外源性物质引起睾丸组织损伤或发生氧化应激时，Nrf2上调HO-1的表达，增强抵抗氧化损伤能力，发挥细胞保护作用[12,18]。而NQO1在氧化应激状态下可以维持关键蛋白质的稳定性[19]，减少氧化损伤。前人研究发现，氧化应激时雄性睾丸组织的HO-1和NQO1在Nrf2的调控下表达上升，以降低氧化应激带来的伤害[12,14,18]。

本试验通过设计干扰siRNA，降低Nrf2在牛睾丸细胞中的表达，观察其对氧化应激相关的基因HO-1和NQO1表达情况。结果显示，siRNA-1672在终浓度为50nmol/L时具有较好干扰效果。Nrf2表达下降时，HO-1和NQO1在mRNA水平上显著下降，说明Nrf2对这两个基因的表达存在一定的影响，而且HO-1和NQO1蛋白质水平上表达也降低。Li等人通过RNA干扰技术降低143B和MG63细胞中Nrf2的表达，发现在Nrf2被抑制后，HO-1和NOQ1的表达也明显降低，细胞内活性氧水平升高[19]。本试验中，睾丸细胞中Nrf2表达被抑制后，HO-1和NQO1的表达也随之降低，该结果与前人研究结果相符合。但Nrf2在睾丸细胞中的功能及其作用机制需要进一步的明确。

4 结论

设计的siRNA-1672能显著降低Nrf2的mRNA表达水平。同时，HO-1和NQO1在mRNA水平上显著下降，显示Nrf2对HO-1和NQO1存在一定的调控作用。而且在Nrf2被抑制后HO-1和NQO1的蛋白表达也随之降低。Nrf2对睾丸细胞的作用，以及对HO-1和NQO1调控机制需要进一步的研究。