SIRT3基因多态及其与德州驴生长性状的关联分析

李 梅，安小娅，裴浩宇，白福霞，王 刚，王延涛，于 杰，党瑞华*

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.山东东阿阿胶公司，山东 东阿 252299)

生长性状是畜牧业生产中关注的一个重要的经济性状，是衡量育种价值及经济效益的重要指标，寻找相关的分子标记可以缩短对生长性状的育种年限。SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。对于SNP的研究方法有毛细管电泳、变形高效液相色谱(DHPLC)、质谱分型等，质谱分型的发展基于20世纪80年代产生的一些新的软电离方式，包括电喷雾电离质谱(electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱(matri-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry，MALDI-MS)等，目前国外已有诸多文献报道生物质谱在SNP分型方面的应用，主要采用MALDI-TOFMS方法[1]。

Sirtuins家族是广泛存在于地球所有生命形态中的具有共同催化结构的古老蛋白质，在包括细菌、针具、酵母菌、疟原虫、后生动物、哺乳动物甚至病毒等生命体中都广泛保守[2-4]。编码该酶家族的类sirtuin基因包括SIRT1、SIRT2和SIRT3，是组蛋白去乙酰化酶家族中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性家族成员，在衰老、代谢和凋亡中发挥重要作用[5]。SIRT3[沉默配对型信息调节3(silent mating-type information regulation 3)]是SIRT3编码sirtuin家族III类组蛋白去乙酰化酶，定位于线粒体基质中[6]，可通过去乙酰化线粒体中与ATP生产相关的酶从而调剂ATP的生成[7]。2010年Zhao等[8]通过高通量蛋白质组学证实，参与三羧酸循环、尿素循环和脂肪酸的β氧化等代谢的蛋白质可被乙酰化修饰，而在线粒体中大约1/5的蛋白质可被乙酰化，结合SIRT3的活性，SIRT3可通过调控线粒体蛋白质乙酰化水平来参与代谢活动。因此，SIRT3可通过调节呼吸链、三磷酸腺苷(ATP)的产生以及柠檬酸和尿素循环在调节能量代谢和衰老过程中发挥重要作用，于代谢旺盛的组织如肌肉、褐色脂肪、肾脏、肝脏、脑和心脏等富含线粒体的组织器官中表达较高[9]。敲除SIRT3基因会导致机体的线粒体过度乙酰化，造成细胞能量代谢及有丝分裂过程发生异常[10]。

王海涛等人[11]研究发现，SIRT3在骨骼肌中也高表达，参与能量代谢并影响机体的衰老、细胞死亡和肿瘤发生，且经过验证，适度的运动会增加骨骼肌中的SIRT3含量并进一步影响脂肪代谢。有研究[12]表明，SIRT3启动子转录因子结合位点的多态性可能影响SIRT3的转录活性，从而改变肉牛肌内脂肪含量，且SIRT1和SIRT2基因的基因型组合对秦川牛眼肌面积和肌间脂肪有显著影响。在心脏、肝脏和肾脏等代谢旺盛的组织中，ATP水平较高，且SIRT3也具有较高的表达水平，由此推测SIRT3的表达有利于ATP的生成，从而用于机体的运动代谢等，使得机体相应部位相对发达，所以和动物的体尺性状有一定的关联[13]。

目前关于SIRT3基因的多态性研究较少，在动物体尺性状方面仅在秦川牛上做了相关研究，而未见关于驴的相关报道，鉴于SIRT3基因在能量代谢和脂质代谢过程中的重要作用，我们推测其在驴的生长性状方面可能有直接或间接地作用。因此，本研究拟以SIRT3基因为目标基因，采用质谱分型方法，分析不同标记基因型与德州驴生长性状之间的关系，以期为德州驴分子育种提供可参考的基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

血样采自山东省德州市东阿阿胶公司驴场，选择同等饲养条件下的30月龄以上健康的214头公驴、190头母驴。对每头驴颈静脉采血10 mL，ACD抗凝(V(ACD)∶V(血液)=1∶6)，置于-80 ℃保存。同时采集试验驴的9个生长性状指标(体高、体长、胸围、胸宽、胸深、管围、尻长、尻宽、尻高)。

1.2 基因组DNA的提取及检测

采用常规的苯酚—氯仿提取法[14]提取德州驴血样基因组DNA，提取的DNA用TE缓冲液处理后，采用0.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用分光光度计检测D260/D280值，放入-20 ℃保存备用，在使用时稀释至50 ng/μL，保存在4 ℃。

1.3 SIRT3基因多态性鉴定、基因分型

根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的驴SIRT3序列(GenBank NC_19763和NC_35148)，针对编码区利用Primer 5.0软件设计引物，引物均由上海生物技术有限公司合成。

PCR反应体系25 μL：含有核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer的Mix 12.5μL，ddH2O 9.5 μL，上游、下游引物各(10 pmoL/μL)1.0 μL，模板DNA(50 ng/μL)1.0 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，退火30 s(引物序列及退火温度见表1)，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。将所有个体DNA稀释到适宜浓度并送往康普森生物技术有限公司进行质谱分型。每个位点随机选取20个样本进行PCR扩增并送至上海生物工程股份有限公司进行测序，测序结果使用SeqMan软件进行对比分析，进行验证。

表1 SIRT3-1和SIRT3-2位点的引物信息

1.4 统计学分析

用Excel对基因遗传变异质谱分型结果进行统计分析，利用哈代—温伯格平衡检验软件对2个突变位点的基因型频率、等位基因频率和哈代—温伯格平衡(HWE)进行了分析。同时，运用在线软件(http:///www.msrcall.com/)估算纯合子(Ho)、杂合子(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)。使用SHEsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalases)检测位点之间的连锁不平衡强度，采用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析和独立样本T检验分析分析德州驴基因型与生长性状的相关性，结果用“平均数±标准误”表示(P<0.05为差异显著水平)。

2 结果与分析

2.1 德州驴SIRT3基因的多态性检测

随机选取德州驴的DNA样本作为SIRT3-1和SIRT3-2位点的PCR扩增模板，产物加入浓度为1%的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。同时，对扩增产物进行测序和验证。在SIRT3-1(g.19763T>C)发现了TT、TC、CC 3个基因型，在SIRT3-2(g.35148A>G)发现了AG、GG 2个基因型，测序结果如图1。将404头德州驴的DNA样品送到康普生生物技术有限公司进行质谱分析，SIRT3-1和SIRT3-2位点分型结果如图2所示。

2.2 群体遗传学分析、连锁不平衡分析

从群体遗传学角度分别分析这2个SNPs的基因型频率和等位基因频率，并进行卡方检验检测Hardy-Weinberg平衡状态，结果如表2、表3所示。SIRT3-1位点上，TC基因型频率最高，PIC范围约为0.30，说明母驴和公驴具有中度多态性(0.250.05)。

表2 德州驴SIRT3-1位点基因型、等位基因频率及群体遗传参数

表3 德州驴SIRT3-2位点基因型、等位基因频率及群体遗传参数

在连锁不平衡分析中，连锁强度的大小可以用D’和r2表示。r2<0.33表示SIRT3-1和SIRT3-2没有连锁关系，如图3。

2.3 SIRT3基因型与生长性状的关联分析

对德州驴214头公驴和190头母驴的9个生长性状分别与SIRT3基因2个SNPs位点不同基因型进行关联分析，结果见表4、表5。在SIRT3-1位点，公驴和母驴的TT型个体在体高和尻长方面均显著性高于TC型个体均值(P<0.05)，即公母驴存在一致的显著性差异。此外，公驴中TT型个体均值在尻高方面也显著高于TC型个体均值(P<0.05)，而CC型个体均值在管围方面显著高于TT型个体均值(P<0.05)(如表4)。在SIRT3-2位点，公驴和母驴GG基因型个体均值在胸宽方面显著高于AG型个体均值(P<0.05)，公驴GG型个体均值在尻宽方面极显著高于AG型个体均值(P<0.01)(如表5)。

表4 德州驴SIRT3-1位点不同基因型与生长性状的关联分析

表5 德州驴SIRT3-2位点多态与生长性状的关联分析

3 讨 论

Shi等人[15]研究发现，SIRT3可被寒冷刺激诱导并在棕色脂肪组织中表达冷暴露会增加小鼠棕色脂肪SIRT3 mRNA水平，静息状态下骨骼肌70%的能量来源于脂肪的分解代谢，由此可推测骨骼肌中SIRT3的表达对脂肪代谢具有重要影响。

研究[16-24]表明，SIRT3基因的突变位点与大围子猪和湖村黑猪的肉质性状存在显著性相关，表现为在SIRT3基因第5外显子上存在的SNP突变位点显著影响大围子猪的24 h滴水损失、失水率和肌内脂肪含量(P<0.05)。Gui等人[5]对SIRT1、SIRT2和SIRT3 3个基因的4个SNP位点与牛的体尺性状进行关联分析，发现仅有SIRT1的基因变异及其相应的基因型可以作为牛育种经济性状的分子标记。邓冠群等[10]人对秦川牛SIRT3基因的研究表明，不同位点的不同基因型与体斜长、体高、腰角宽、尻长、胸深、胸围、背膘厚、眼肌面积和肌内脂肪含量显著(P<0.05)或极显著相关(P<0.01)。

本试验通过质谱分析对190头母驴、214头公驴共404头德州驴的SIRT3基因进行了多态性分析，发现了2个多态位点。通过基因分型在SIRT3-1发现3种基因型，而SIRT3-2只有两种基因型，这可能与试验中选择的群体过小或者在进化过程中自然和人为定向选择有关。相对于外显子区域的突变，越来越多的研究表明，内含子区域的突变也能对性状产生显著的影响。虽然内含子的突变不会对编码的氨基酸序列发生影响，但其可能对顺式作用元件的功能产生影响或者改变细胞内mRNA的可变剪切，进而对基因的功能或者表达产生影响。

4 结 论

本研究发现SIRT3基因在德州驴中存在多态且与生长性状显著关联，德州驴群体中SIRT3基因的2个SNPs位点与体高、尻高、尻长、胸宽这4个生长性状有显著的相关性，说明SIRT3基因多态有潜力作为影响生长性状的候选分子标记用于辅助选择，这为德州驴的选育工作提供了科学依据。