德州驴GDF10基因多态鉴定及其与生长性状的关联分析

白福霞，李 梅，裴浩宇，安小娅，王 刚，王延涛，于 杰，党瑞华*

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.山东东阿阿胶公司，山东 东阿 252299)

生长/分化因子-10(GDF10)是转化生长因子-β(TGF-β)家族的成员，也称为骨形态发生蛋白-3b(BMP-3b)，与骨形态发生蛋白3(BMP-3)高度相关，BMP-3b和BMP-3的成熟区大约80%的氨基酸序列具有同一性[1-2]。最初是从大鼠股骨组织中发现的一种新型BMP-3相关蛋白[3-4]。GDF10存在于新生儿和成人骨样本中，在颅骨中检测到的水平高于在长骨中检测到的水平，并且GDF10基因表达与大鼠颅骨中成骨细胞的分化相关。因此，GDF10在调节参与骨骼形态发生的细胞分化事件中发挥重要作用。GDF10不仅在骨骼和发育中的胚胎中高表达，而且在哺乳动物脂肪组织中表达较高[5]。已有研究表明BMP-3b在脂肪细胞中表达，以自分泌方式调节脂肪细胞分化，并作为独特的非共价复合物由脂肪细胞分泌，在调节小鼠脂肪生成和代谢中具有重要作用[6-8]。GDF10基因多态位点与南德温杂交肉牛和甘南牦牛的体斜长、体高和胸围生长性状显著相关，可以作为牛生产性状的候选分子标记，为牛遗传资源开发与利用提供科学依据[9-11]。

目前对于驴重要性状的分子标记主要集中在生长，毛色、毛的长短，乳用及皮用等性状。Lai等研究结果表明德州驴肌肉组织中IGF1基因的表达量随年龄增长而降低。多态位点和单倍型组合关联分析结果表明，IGF1基因的2个突变位点与德州驴的生长性状有关[12]。Wang等发现TBX3基因内含子2中g.3624A>G SNP位点与德州驴体型性状显着相关[13]。ASIP、MC1R、KIT基因可作为毛色候选基因，将驴的毛色区分开来，可以作为驴品种鉴定和个体识别的重要依据[14-15]。运用PCR-SSCP方法对疆岳驴PRLR基因侧翼区进行多态性分析，PRLR基因突变与泌乳性状存在关联性，可以作为疆岳驴乳用型选育的分子遗传标记之一[16]。

德州驴形成历史悠久，以耐粗饲、抗病力强、饲料消耗较少、行动灵活和善于运输而著称，其体格高大，结构匀称，体质紧凑、结实、方正，是我国重要的驴遗传资源[17]。前期已有试验结果表明GDF10基因对牛的生长性状具有显著影响，但是在驴中还缺乏该基因多态性与生长性状的相关研究。本研究以德州驴为研究对象，分析GDF10基因在德州驴群体中的遗传多态性以及与生长性状的关联性，进而得到与生长性状显著相关的遗传标记，用于德州驴的分子标记辅助选择，并为育种提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

采集山东省东阿阿胶股份有限公司德州驴养殖基地440头德州驴的血液样品。并测量其生长性状的体尺数据，其中包括体高、体长、胸围、胸宽、胸深、管围、尻长、尻宽、尻高9个生长性状。根据标准苯酚—氯仿法从颈静脉采集的血样中提取DNA，并将DNA样品保存于-80 ℃。利用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2 引物设计与合成

根据NCBI数据库中驴公开的GDF10基因序列(登录号：NW_014637621.1)，利用Primer 5.0软件设计特异性引物，并于北京擎科生物科技有限公司合成，引物相关信息见表1。

表1 驴GDF10基因PCR扩增引物信息

1.3 PCR扩增与基因分型

PCR反应体系为12.5 μL，包括：2xEs Taq Master Mix 6.25 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 4.25 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共30个循环；在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.4 统计分析

根据群体遗传学理论，计算基因型和等位基因频率，应用在线软件(http://www.msrcall.com/)计算德州驴种群GDF10基因多态位点的纯合度Ho(homozygosity)、杂合度He(heterozygosity)、有效等位基因数Ne(effective number of alles)和多态信息含量PIC(polymorphism information content)，并检验SNP位点是否处于哈迪—温伯格(Hardy-Weinberg)平衡状态。

利用SHEsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析3个SNPs位点间的连锁不平衡(LD)关系。并通过SPSS 18.0统计分析软件进行单因素方差分析不同基因型与生长性状的关联分析。结果以平均值±标准差表示，P<0.05表明差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 GDF10基因SNPs位点筛选及质谱分型结果

根据测序结果发现在GDF10基因的3′-UTR区域，外显子和内含子中共发现了3个SNP位点，(g.2031481 A>G，g.2041898 A>G，g.2043035 C>T)，3个SNP位点均检测到3种基因型，测序结果见图1。

使用质谱分型技术对检测到的SNPs位点在德州驴群体中进行基因型分型，g.2031481 A>G和g.2043035 C>T位点分型结果分别见图2(a)和图2(b)。

2.2 驴GDF10基因的群体遗传参数分析

由表2可知，g.2031481A>G位点在母驴中的优势基因型为AG，优势等位基因为G，基因频率为0.682，而在公驴中的优势等位基因型为GG，优势等位基因为G，基因频率为0.722。g.2041898 A>G位点在母驴和公驴群体中的优势基因型均为AG，优势等位基因均为G，基因频率分别为0.571，0.580。g.2043035 C>T位点在母驴和公驴群体中的优势基因型均为TC，优势等位基因均为T，基因频率分别为0.547，0.521。3个SNPs位点均显示突变后的基因为优势等位基因。卡方检验结果显示，上述3个SNPs位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。

表2 德州驴GDF10基因型频率、等位基因频率及哈迪温伯格平衡检验

由表3可知，g.2031481 A>G位点上的遗传参数纯合度(Ho)的值大于杂合度(He)，PIC范围在0.30左右，处于中度多态性。g.2041898 A>G位点纯合度(Ho)的值均大于杂合度(He)，PIC范围在0.30左右，处于中度多态性。g.2043035 C>T位点上纯合度(Ho)的值均大于杂合度(He)，PIC范围在0.30左右，处于中度多态性。

表3 德州驴GDF10基因群体遗传参数

0.250.50。

2.3 GDF10基因多态的连锁不平衡分析与单倍型构建

通过SHEsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis)对德州驴GDF10基因3个SNPs位点进行连锁不平衡分析，结果如图2所示。在母驴和公驴中，rs2(g.2041898 A>G)和rs3(g.2043035 C>T)2个位点间存在强连锁不平衡(r2分别为0.681和0.792，均大于0.33)。

对GDF10基因的SNPs位点进行单倍型分析，在本实验群体中各发现5个单倍型(frequency>0.03)，并标记为Hap1-Hap5。母驴中优势单倍型为Hap5，频率为0.304；而公驴中的优势单倍型为Hap3，频率为0.339。

表4 驴GDF10基因SNPs位点单倍型构建

2.4 GDF10基因多态的基因型、单倍型与生长性状的关联分析

将德州驴GDF10基因3个SNPs位点的不同基因型与德州驴体高、体长、胸围、胸宽、胸深、管围、尻长、尻宽和尻高9个生长性状进行关联分析，分析结果见表5。结果显示，在母驴中，g.2031481 A>G位点AA基因型个体的尻高显著高于GA基因型个体(P<0.05)；g.2041898 A>G位点AA基因型个体的体高和尻长显著高于GA基因型个体(P<0.05)；g.2043035 C>T位点CC基因型个体的尻长显著高于CT基因型个体(P<0.05)。在公驴中，除了g.2043035 C>T位点CC基因型个体的体高显著低于CT基因型(P<0.05)，其余位点的基因型生长性状之间并没有显著性差异(P>0.05)。

表5 GDF10基因SNPs位点与德州驴生长性状的关联分析

3 讨 论

目前，GDF10基因的研究结果较少，主要集中在一些疾病方面和骨骼发育方面。GDF10基因可以促进中风后神经修复[18-19]，此外，这种基因可能充当肿瘤抑制因子，并且该基因的表达降低与口腔癌有关[20]。GDF10基因在小鼠和人股骨组织中均有表达，并在成骨细胞分化中起重要作用，GDF10基因的缺失会影响胚胎颅骨的发育[4]。因此，GDF10基因在细胞分化过程中起重要作用，参与骨骼的发育和形成。已有研究报道GDF10基因与牛的生长性状有关，可以作为牛生长发育的分子标记。在GDF10基因家族的研究中，GDF-8 c.1231C>T多态性与Kielecka鹅在12周龄时的BW(体重)存在关联[21]。GDF-8基因中的5′UTR区碱基对的插入缺失与山羊体高、胸宽指数显著相关，特定基因型可能有利于山羊的标记辅助选择(MAS)[22]。GDF-9基因的单核苷酸多态性对羊的繁殖力性状有影响，多见于产仔数方面[23-25]。但是目前为止，关于GDF10多态性与德州驴生长性状的关联分析未见报道。

本试验以GDF10基因为候选基因，对440头德州驴进行多态性检测，得到了3个SNPs位点。g.2031481 A>G位点突变产生2个等位基因A和G，3种基因型：AA、GA、GG，其中G为优势等位基因，而在母驴和公驴中的优势基因型不一致，母驴中的为AG，公驴中的为GG。g.2041898A>G位点的优势基因为G，优势基因型为GA。而g.2043035 C>T位点优势基因为T，优势基因型为CT。3个位点的优势基因和基因型基本上为突变后的基因。3个位点的遗传参数纯合度均大于杂合度，且多态信息含量(PIC)均处于中度多态(0.25

已有较多的研究表明GDF10基因与骨骼发育有着重要作用，且与多个中国地方牛品种生长性状相关。通过对GDF10基因的3个SNPs位点和德州驴生长性状关联分析发现，在母驴中，g.2031481 A>G位点在尻高上表现出显著性差异；g.2041898A>G位点在个体的体高和尻长上表现出显著性差异；g.2043035 C>T位点在尻长上表现出显著性差异。而在公驴中，只有g.2043035 C>T位点显著影响体高性状。

GDF10基因多态性显著影响德州驴的部分生长性状，可作为与德州驴产性状有关的候选分子标记，应用于德州驴生产的分子标记辅助选择育种。

4 结 论

德州驴群体中GDF10基因的3个SNPs位点与部分生长性状(体高、尻高、尻长)有显著的相关性，说明GDF10基因可以作为生长性状分子辅助选择的潜在遗传标记，以提高德州驴生长性能。