二甲双胍对心肌梗死后心脏功能的影响及其机制研究

周慧鑫 谌虎 刘志豪 周雨扬 李泽衍 许骁 陈华强 刘承哲 刘旨浩 王宇虹 王悦怡 赖燕秋 余锂镭 江洪

(武汉大学人民医院心血管内科 武汉大学心脏自主神经研究中心 武汉大学心血管病研究所 心血管病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是中国城乡居民死亡的重要原因，并且其发病率不断升高。据统计，中国急性MI发病率城市为50.12/10万，农村为43.51/10万，急性MI死亡率城市为58.69/10万，农村为74.72/10万[1]。MI发生后心肌细胞和中枢神经系统释放大量去甲肾上腺素，导致交感神经系统过度激活[2]。既往研究[3]表明交感神经系统与心血管疾病之间存在密切联系，交感神经过度激活会加重MI后心肌重构，并恶化左心室舒张和收缩功能。

二甲双胍是目前治疗2型糖尿病最常用的药物[4]。除了治疗糖尿病，二甲双胍还可改善神经退行性疾病[5]，并且对高血压、肺动脉高压和缺血性心脏病等心血管疾病有着保护作用[6-8]。研究发现，二甲双胍不仅能降低骤然升高的去甲肾上腺素水平[6]，还可改善长时间高血压所致的自主神经功能障碍[9]。然而，二甲双胍是否可通过调节心脏自主神经改善MI后心脏功能尚不明确。因此本研究旨在探索二甲双胍对MI后心脏功能的影响及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物准备

武汉大学人民医院实验动物中心提供28只健康成年雄性Sprague Dawley大鼠(180～230 g)，在无特定病原体环境下适应性饲养1周，给予标准饲料和饮水。本实验所有动物使用过程均经武汉大学动物实验伦理委员会审核并批准。

1.2 动物模型制备和干预流程

Sprague Dawley大鼠随机分成3组：假手术组(n=8)、MI+生理盐水处理组(MI组，n=10)和MI+二甲双胍处理组(MET组，n=10)。MI组和MET组均采用冠状动脉左前降支(left anterior descending branch，LAD)结扎法制备MI模型。大鼠术前禁食禁饮12 h，采用3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于实验台，气管插管，连接小动物呼吸机给予人工通气。左前胸剃毛备皮，消毒后开胸，打开心包，暴露心脏，于左心耳下缘2 mm处用结扎线结扎LAD，制备MI模型。清理胸腔后逐层关闭胸腔，待大鼠恢复自主呼吸后拔管撤离呼吸机，保暖直至清醒。假手术组同样开胸，LAD处穿线而不结扎，其余操作步骤同MI造模。术后MET组给予二甲双胍[200 mg/(kg·d)]灌胃，假手术组和MI组大鼠给予等量生理盐水灌胃，干预4周。

1.3 超声心动图采集

采用多普勒超声心动仪对大鼠进行超声心动图检查，检测指标包括左室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室收缩末期内径(LVESD)和左心室舒张末期内径(LVEDD)。

1.4 心电图测量及心率变异性分析

根据团队前期研究方法[10]，麻醉状态下记录大鼠体表心电图，并使用Lab Chart 8.1软件进行数据分析。分析计算各组心率变异性(heart rate variability，HRV)频域指标，低频功率(LF)、高频功率(HF)和低频/高频功率比值(LF/HF)，为消除个体差异，LF、HF均经过标准化并采用标准化单位(nu)表示。LF反映交感神经的活性，而HF反映副交感神经的活性。LF/HF反映自主神经系统的平衡状况。

1.5 血清和心肌标本检测

实验结束前，从大鼠腹主动脉收集动脉血，使用惰性分离胶促凝管促凝，血液离心(3 000 r/min，10 min)后取上清液于-80 ℃冷冻保存。根据诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的酶联免疫吸附测定试剂盒说明书，检测血清iNOS水平。实验结束后，迅速取左心室心肌组织，使用磷酸盐缓冲溶液反复冲洗，液氮速冻，于-80 ℃冷冻保存。根据丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的生化试剂盒说明书，检测心肌MDA和SOD水平。

1.6 免疫组织化学染色

实验结束后，从左心室梗死交界区收集心肌组织，于4%多聚甲醛固定液固定24 h以上，乙醇脱水和石蜡包埋后制作切片。行酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)免疫组织化学染色并拍取照片，使用Image Pro Plus 6.0软件测量分析，测量并计算TH阳性区域的分布密度。

1.7 统计学分析

2 结果

造模过程中，假手术组、MI组、MET组分别死亡1、1、2只大鼠。造模1周内，假手术组、MI组、MET组分别死亡1、3、2只大鼠。

2.1 二甲双胍显著改善MI大鼠的心功能

见表1可知，与假手术组相比，MI组大鼠LVEF[(43.19±3.59)% vs (84.65±3.12)%，P<0.05]和LVFS[(18.70±2.02)% vs (48.32±3.64)%，P<0.05]显著降低，LVEDD[(0.83±0.09)cm vs (0.56±0.08)cm，P<0.05]和LVESD[(0.67±0.08)cm vs(0.29±0.04)cm，P<0.05]显著增加。而与MI组相比，MET组大鼠LVEF[(59.22±6.50)% vs (43.19±3.59)%，P<0.05]和LVFS[(27.48±3.95)% vs (18.70±2.02)%，P<0.05]显著升高，LVEDD[(0.65±0.08)cm vs (0.83±0.09)cm，P<0.05]和LVESD[(0.48±0.08)cm vs (0.67±0.08)cm，P<0.05]显著减少。

表1 二甲双胍对MI大鼠心脏超声心动图参数的影响

2.2 二甲双胍对MI大鼠HRV的影响

见表2可知，与假手术组比较，MI组的LF/HF(0.33±0.02 vs 0.02±0.01，P<0.05)和LF[(20.35±0.68)nu vs (1.65±1.35)nu，P<0.05]均显著升高，HF[(62.72±1.83)nu vs (93.73±2.96)nu，P<0.05]显著降低；与MI组相比，MET组LF/HF(0.28±0.01 vs 0.33±0.02，P<0.05)和LF[(17.24±1.98)nu vs (20.35±0.68)nu，P=0.05] 均降低，HF可见回升趋势，但无统计学意义。

表2 二甲双胍对MI大鼠HRV的影响

2.3 二甲双胍对MI大鼠心脏交感神经重构的影响

见图1可知，与假手术组相比，MI组左心室梗死交界区心肌TH密度[(11 244±2 239)μm2/mm2vs (537.7±360.5)μm2/mm2，P<0.05]显著增加，与MI组相比，MET组TH密度[(5 461±2 166)μm2/mm2vs (11 244±2 239)μm2/mm2，P<0.05]降低。

2.4 二甲双胍对MI大鼠心脏氧化应激的影响

见表3可知，与假手术组相比，MI组血清iNOS水平[(14.59±2.56)U/mL vs (7.15±0.82)U/mL，P<0.05]和心肌MDA水平[(16.87±1.43)nmol/mgprot vs (12.43±1.83)nmol/mgprot，P<0.05]明显升高，心肌SOD水平[(262.30±7.39)U/mgprot vs (294.10±15.47) U/mgprot，P<0.05]明显降低；与MI组相比，MET组血清iNOS水平[(9.26±1.14)U/mL vs (14.59±2.56) U/mL，P<0.05]和心肌MDA水平[(14.52±1.13) nmol/mgprot vs (16.87±1.43) nmol/mgprot，P<0.05]明显降低，心肌SOD水平[(283.60±13.65) U/mgprot vs (262.30±7.39)U/mgprot，P<0.05]明显升高。

注：**表示与假手术组相比，P<0.05；▲▲表示与MI组相比，P<0.05。

表3 二甲双胍对MI大鼠心脏氧化应激的影响

3 讨论

二甲双胍是治疗2型糖尿病的经典药物，对心血管具有保护作用，可降低糖尿病和非糖尿病患者的心血管风险[11]。队列研究[12]显示，急性MI后服用二甲双胍不仅减少主要心血管不良事件的发生，还降低心血管疾病的死亡率和心力衰竭患者的再入院率。此外，二甲双胍通过促进一磷酸腺苷活化蛋白激酶的磷酸化，改善缺血心肌的能量交换，抑制钾通道的开放，提高心室电生理稳定性，起到预防心室颤动的作用[8]。Li等[13]研究发现，二甲双胍通过改善心脏脂肪酸氧化，减少氧化应激，从而改善慢性高血压所致的左心室肥大和心功能障碍。二甲双胍与自主神经相关，不仅降低骤然升高的去甲肾上腺素水平[6]，还能改善高血压相关的心脏自主神经功能障碍[9]。本研究通过LAD结扎建立MI模型，给予二甲双胍慢性干预，发现二甲双胍可改善MI后的心脏功能。

自主神经系统在心脏的生理和病理过程中起着至关重要的作用。目前研究[14-15]认为，交感神经的过度激活是诱发并恶化MI后心力衰竭和恶性心律失常的重要机制。笔者团队[10，16]前期研究发现，抑制心脏交感神经节可有效抑制MI后恶性室性心律失常的发生和心肌重构。HRV和儿茶酚胺的定量检测等是判断自主神经活动的重要指标[17]。TH是肾上腺素合成过程的关键酶，分布在肾上腺素能神经的胞质中，其阳性水平可反映交感神经的重构程度[18]。本研究发现，二甲双胍不仅能降低MI大鼠HRV中反映交感神经系统激活的LF/HF，还减少了MI导致的TH密度增加，提示一定程度的交感神经抑制作用。若实验条件允许，进行24小时心电图记录并分析HRV，将得到更详细和精确的结果。

氧化应激是导致心肌缺血后心脏功能进一步恶化的重要原因，活性氧被认为是诱发氧化应激的关键物质。临床和动物研究[19]表明，减少活性氧的产生可减少缺血所致心肌损伤。iNOS与氧化应激水平密切相关，iNOS表达增加导致一氧化氮过量产生，一氧化氮迅速与超氧阴离子反应生成过氧亚硝酸盐，其可引起大分子广泛氧化，导致大鼠心功能不全[20]。血清iNOS释放增加常伴随着MDA水平升高和SOD水平降低，提示抗氧化应激物质的耗竭[21]。并且在中枢交感神经核团内过表达iNOS后，可通过升高氧化应激水平激活交感神经[22]。同时，交感神经激活引起的心肌收缩力增强和心率升高，会增加心肌耗氧和抗氧化物质的耗竭，从而导致氧化应激水平显著升高，形成交感神经激活和氧化应激之间的恶性正反馈，加重心肌损伤。

本研究显示，二甲双胍的全身干预可能通过抑制交感神经活性和降低iNOS表达水平而发挥抗氧化应激作用，从而改善MI后心脏功能。因此，补充二甲双胍有望为MI患者的心肌保护治疗提供新的思路。