樟芝深层发酵菌丝体提取物对食源性致病菌的抑制作用

李华祥，石 蠫，蒋文浩，王娟娟，陆春雷，高亚军，贾禄强，杨振泉*

（1 扬州大学食品科学与工程学院 江苏扬州 225127 2 江南大学食品学院 江苏无锡 214122）

樟芝（Antrodia camphorate 或Taiwanofungus camphoratus），又名牛樟芝、牛樟菇等，是一种大型珍稀药食两用真菌，属于担子菌纲、多孔菌目、薄孔菌属，素有“药芝之王”、“森林红宝石”之美誉[1-2]。国内外大量研究证实樟芝在保肝、抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎症、抗氧化、降血压、降血脂、缓解疲劳及调节免疫等方面具有显著功效[3-5]。随后，研究者们从樟芝子实体及发酵菌丝体中分离出百余种活性物质，主要包括三萜类、多糖类及苯环类等，具有较大的研究潜力及开发价值[6]。

国外学者Geethangili 等[7]研究发现，樟芝的氯仿及正己烷提取物均能显著抑制幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的生长。Lien 等[8]发现，樟芝的3种有机溶剂（乙醇、氯仿及乙酸乙酯）提取物均对口腔细菌变异链球菌（Streptococcus mutans）和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）的生长具有显著抑制效果，其MIC 值为4～16 μg/mL。国内学者杨淑贤等[9]及汪雯翰等[10]发现，樟芝的3 种有机溶剂（甲醇、氯仿及正丁醇）提取物均对金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的生长具有显著抑制效果。李娟等[11]发现，樟芝乙酸乙酯提取物对7 种多重耐药性人体致病细菌的生长具有显著抑制效果。

有关樟芝菌丝体提取物在抑制食源性致病菌方面的研究较少，尤其是对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）及霍乱弧菌（Vibrio cholerae）等弧菌和阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）的生长抑制效果研究尚显不足。本文以成本低廉且较易获得的樟芝深层发酵菌丝体[12]为原料，研究樟芝菌丝体不同提取物对15 种食源性致病菌的抑制作用，进一步补充和完善樟芝活性物质在抑菌方面的研究，为开发新型安全高效、功能多样的食品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株 本文所用樟芝及所有食源性致病菌菌株均为本实验室保藏菌株[13]。

1.1.2 试剂 本文中培养樟芝斜面所用的PDA培养基、培养食源性致病菌所用的LBS 培养基及LB 培养基，上海生工；用于配制樟芝发酵培养基的相关试剂及其它常规试剂（分析纯），国药集团（中国）。

1.2 方法

1.2.1 樟芝菌丝体的收集 根据樟芝深层发酵的前期研究成果，采用5 L 发酵罐按照文献[14]中的培养基配方（葡萄糖2%，酵母浸出粉0.2%，MgSO40.15%，KH2PO40.3%，pH 4.5）和发酵条件（接种量为1×106spore/mL，26 ℃，150 r/min，发酵10 d）进行樟芝深层发酵，结束后用4 层纱布过滤并收集樟芝菌丝体。

1.2.2 樟芝活性物质的提取 将樟芝菌丝体与甲醇、乙醇、乙酸乙酯或蒸馏水按料液比为1∶10 的比例混合，超声处理45 min 后，静置过夜。然后离心（8 000 r/min，10 min，4 ℃）收集上清液，即得樟芝菌丝体提取液[15]。

将樟芝有机溶剂提取液70 ℃水浴蒸干后，称重并用DMSO 溶剂复溶；将樟芝水提取液真空冷冻干燥，称重后用水复溶。最终获得已知浓度的樟芝菌丝体提取液。

1.2.3 致病菌的培养及稀释 参照石瑀等[16]的方法，将食源性致病菌分别接种于LBS 培养基（弧菌）及LB 培养基（非弧菌）中，37 ℃培养12 h。再用无菌生理盐水梯度稀释（梯度为10，共稀释10个梯度）并吸取100 μL 各稀释菌液均匀涂布于平板上，培养10～12 h 后进行菌落计数。最后，根据菌落计数结果将每个测试菌的培养液用生理盐水稀释到1×105CFU/mL 备用。

1.2.4 抑菌谱的测定 测定樟芝菌丝体提取物的部分抑菌谱时，我们采用的是牛津杯法[17]，具体操作参照陆春雷等[13]和石瑀等[16]的方法，每个试验组均设置3 个生物重复。

1.2.5 最小抑菌浓度的测定 测定樟芝菌丝体提取物对食源性致病菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC） 时采用二倍稀释法[18]，具体操作参照陆春雷等[13]和石瑀等[16]的方法，设置生理盐水空白对照组及DMSO 溶剂对照组，每个组均设置6 个生物重复。我们将溶剂无抑菌效果（即根据分光光度计检测及肉眼观察结果，判断抑菌率为0） 且樟芝菌丝体提取物完全抑菌（即根据分光光度计检测及肉眼观察结果，判断抑菌率为100%）时所对应的樟芝菌丝体提取物最低添加浓度视为相应的最小抑菌浓度。

1.2.6 抑菌效果验证 测定樟芝菌丝体甲醇提取物对各测试菌的抑菌率时，我们采用的是平板菌落计数法[19]。根据最小抑菌浓度的检测结果，我们选取副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌及最小弧菌3 株菌株作为测试菌以验证樟芝甲醇提取物的抑菌效果。具体操作参照陆春雷等[13]和石瑀等[16]的方法，此处以检测樟芝菌丝体甲醇提取物对金黄色葡萄球菌抑制效果的操作为例进行简要描述。即采用20 mL 玻璃试管为容器，LB 培养基的装液量为5 mL，接入100 μL 浓度为1×105CFU/mL 的金黄色葡萄球菌菌液，再加入400 μL 质量浓度为10 mg/mL 的樟芝菌丝体甲醇提取液（此浓度在最小抑菌浓度检测试验中抑菌效果理想且对应的溶剂无抑菌效果），将试管置于37 ℃、120 r/min 摇床中培养，并于8，10，12 h 分别取样进行平板菌落计数。以相同体系中添加400 μL 无菌生理盐水代替樟芝菌丝体甲醇提取液的试管作为空白对照组，每组设置3 个生物重复，根据菌落计数结果计算樟芝菌丝体甲醇提取物对测试菌株的抑菌率。检测樟芝菌丝体甲醇提取物对副溶血性弧菌及最小弧菌的抑菌率时，除了将LB 培养基替换成LBS培养基以外，其余操作均与检测樟芝菌丝体提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌率操作相同。

2 结果与分析

2.1 樟芝菌丝体提取物的抑菌谱

按1.2.2 节中的方法，获得质量浓度分别为49.6，17.6，44.0，82.0 mg/mL 的樟芝菌丝体甲醇提取液（ME）、乙醇提取液（AE）、乙酸乙酯提取液（EE）及水提液（WE）。分别吸取500 μL 上述4 种樟芝菌丝体提取液并将质量浓度统一稀释至15 mg/mL 后，按1.2.4 节中的方法检测樟芝菌丝体不同提取物对15 株食源性致病菌的抑制效果，获得各樟芝菌丝体提取物的部分抑菌谱，结果如表1所示。

由表1可以看出，4 种樟芝菌丝体提取物对大肠杆菌、沙门氏菌及6 株阪崎肠杆菌均无明显抑制作用，但对金黄色葡萄球菌的生长均呈现显著抑制作用。此外，樟芝菌丝体甲醇提取物对5 株弧菌及蜡样芽孢杆菌均有较好的生长抑制效果；樟芝菌丝体乙醇提取物对河流弧菌及创伤弧菌有较好的生长抑制效果；樟芝菌丝体乙酸乙酯提取物仅对金黄色葡萄球菌的生长有较为显著的抑制效果；樟芝菌丝体水提物对霍乱弧菌及创伤弧菌有较好的生长抑制效果。可见，樟芝菌丝体甲醇提取物的抑菌谱最广，能显著抑制15 株测试菌中7 株菌株的生长。

表1 樟芝菌丝体不同提取物的抑菌谱Table 1 The antibacterial spectrum of different extracts from mycelia of Antrodia camphorata

2.2 樟芝菌丝体提取物的最小抑菌浓度

在检测出不同樟芝菌丝体提取物的部分抑菌谱后，我们进一步检测了4 种樟芝菌丝体提取物对其所对应测试菌株的最小抑制浓度，结果如表2所示。

由表2可知，DMSO 对食源性致病菌的生长有一定的抑制作用，但抑制效果随浓度的降低而减弱，直至几乎无抑菌效果。将用DMSO 溶解的樟芝菌丝体提取物的抑菌效果与相同浓度的DMSO（表中同一列数据）抑菌效果相比较后得出，4 种樟芝菌丝体提取物均对7 株测试菌的生长有显著抑制作用，且最小抑菌质量浓度在0.3～41.0 mg/mL 之间。其中，樟芝菌丝体乙醇提物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度最低，为0.3 mg/mL；樟芝菌丝体水提物对弧菌的最小抑菌质量浓度最高，为41.0 mg/mL。

表2 不同樟芝菌丝体提取物对测试菌的抑制作用Table 2 The antibacterial activity of extracts from mycelia of Antrodia camphorata on test bacteria

（续表2）

2.3 樟芝菌丝体甲醇提取物的抑菌效果验证

由于樟芝菌丝体甲醇提取物的抑菌谱最广，抑菌效果最好。因此选择樟芝菌丝体甲醇提取物及3 株致病菌（金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌） 作为樟芝代表提取物及测试菌代表菌株，用20 mL 试管体系培养，并用平板菌落计数法进一步验证樟芝菌丝体提取物对测试菌的抑制效果。

2.3.1 测试菌生长曲线的测定 首先测定了金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌以及最小弧菌21613的生长曲线，以确定最佳取样时间，结果如图1所示。

由图1可知，副溶血性弧菌和最小弧菌的迟滞期、对数期和稳定期分别为0～4 h，4～10 h 和10～12 h；金黄色葡萄球菌的迟滞期、对数期和稳定期分别为0～6 h，6～10 h 和10～12 h。可见，当培养8 h 和10 h 时，3 种菌均处于对数期中期及对数期末期；培养12 h 时，3 种菌均处于稳定期。因此，后续检测樟芝甲醇提取物的抑菌率时，我们分别取培养8，10 h 及12 h 的菌液进行涂布及菌落计数。

图1 测试菌的生长曲线Fig.1 The growth curve of test bacterias

2.3.2 樟芝菌丝体甲醇提取物的抑菌效果 采用平板菌落计数法，检测樟芝甲醇提取物在最小抑菌浓度下对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌不同培养时间的抑菌率，以进一步验证其抑菌效果，结果如表3所示。

表3 樟芝菌丝体甲醇提取物对测试菌的抑菌率Table 3 The antibacterial rate of methanol extracts from mycelia of Antrodia camphorate on test bacterias

由表3可知，樟芝菌丝体甲醇提取物对两株弧菌的抑菌率在对数期中期达到最大值；而樟芝菌丝体甲醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果随培养时间点的增加而增强，在稳定期时抑菌率达到最大值。上述结果表明，樟芝菌丝体甲醇提取物确实能显著抑制金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌以及最小弧菌的生长，且最大抑菌率均在92%以上，抑菌效果较为理想，从而进一步证实了抑菌谱试验及最小抑菌浓度试验数据的可靠性。

3 结论

樟芝菌丝体提取物对15 株食源性致病菌中的7 株（霍乱弧菌、副溶血性弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、最小弧菌、金黄色葡萄球菌及蜡样芽孢杆菌）具有较好的抑制效果，且不同提取物对测试菌的最小抑菌质量浓度范围在0.3～41.0 mg/mL 之间。其中，樟芝菌丝体甲醇提取物的抑菌谱最广，抑菌效果最显著；平板菌落计数试验结果表明，樟芝菌丝体甲醇提取物对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌的最大抑菌率均在92%以上，抑菌效果极其显著，进一步证实了樟芝菌丝体提取物的抑菌效果。本研究结果较具开发价值及应用前景。