急性冠脉综合征大鼠外周血巨噬细胞中脂质稳态与动脉粥样硬化指数相关性研究

南武娟，文申英

(1.咸阳市第一人民医院，陕西 咸阳 712000；2.商洛市中心医院，陕西 商洛 726000)

急性冠状动脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)是一组以冠状动脉内不稳定的粥样硬化斑块破裂或侵袭、继发闭塞性血栓而引发急性心肌缺血的临床综合征，主要包括急性ST段抬高性心肌梗死(ST-elevation myocardial infarction,STEMI)、急性非ST段抬高性心肌梗死(Non-ST-elevation myocardial infarction,NSTEMI)和不稳定型心绞痛(Unstable angina,UA)，患者常表现为发作性胸闷、胸痛、心悸、心绞痛等，可导致心律失常、心力衰竭甚至猝死，且发病率呈现逐年上升的趋势，严重威胁患者的生命健康[1-2]。既往研究[3-4]表明，巨噬细胞泡沫化是ACS发生发展的重要影响因素之一，当巨噬细胞内脂质稳态平衡被打破时，即可发生巨噬细胞泡沫化，从而导致ACS的发生。动脉粥样硬化指数(Atherosclerosis Index,AI)是动脉粥样硬化过程中一系列危险因子和保护因子的比值，临床研究[5]认为，AI是全面衡量动脉粥样硬化程度的重要指标，具有极高的临床诊疗应用价值。然而，关于AI与ACS及外周血巨噬细胞中脂质稳态的相关性，目前鲜有研究报道。因此，本研究旨在探究 ACS模型大鼠外周血巨噬细胞中脂质稳态与AI的关系，以期为ACS的临床鉴别诊断提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物： 选取10只8周龄健康雄性SPF级SD大鼠，体重180～200 g，购自陕西省食品药品检验研究院，许可证号：SYXK(陕)2018-002，常规饲养于恒温恒湿洁净动物房，正常昼夜交替，自由饮食饮水。

1.1.2 主要试剂及仪器：盐酸异丙肾上腺素注射液(国药准字H31021344);RPMI 1640培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS，上海碧云天生物技术有限公司)；超低温冰箱、细胞培养箱(德国Heraeus公司)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；电子天平(METTLERTOLEDO公司)；石蜡组织切片机(德国莱卡公司)；光学显微镜(尼康仪器有限公司)；全自动酶标仪(Finnpipette公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及ACS模型建立：将20只大鼠随机分为对照组和模型组，每组10只。模型组大鼠头部和四肢多点皮下注射30 mg/kg盐酸异丙肾上腺素建立ACS模型，以心电图发生改变为造模成功标准；对照组大鼠给予皮下注射等体积生理盐水。

1.2.2 取样及处理：造模成功后6 h颈椎脱臼处死两组大鼠，碘伏常规消毒，打开胸腔，断开肋骨，无菌操作取出整个心脏和主动脉，以冰冷的无菌PBS冲洗，称重后置于-80 ℃冻存备用。

1.2.3 心肌和主动脉组织形态学观察：取两组大鼠部分心肌和主动脉组织，10%甲醛溶液固定，乙醇脱水，常规石蜡包埋，切5 μm厚连续切片，HE染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察心肌和主动脉组织形态学变化。

1.2.4 心肌梗死面积比例和易损指数：取两组大鼠部分心肌组织病理切片并称重，沿白色梗死区域边缘切下梗死的心肌组织，称重，以梗死心肌组织的重量与整个心肌组织的重量之比表示心肌梗死面积比例。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件定量测算细胞外脂质、泡沫细胞及胶原成分的含量，并按下述公式计算易损指数：易损指数=细胞外脂质+泡沫细胞/平滑肌细胞+胶原。

1.2.5 外周血巨噬细胞中脂质含量的测定：各只眼眶取血4 ml，转移至培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育2 h，待细胞贴壁生长后倒掉培养基，加适量无菌PBS轻轻洗去悬浮的细胞，再以胰蛋白酶消化并吹打重悬细胞，转移至离心管，1000 r/min离心5 min，吸弃上清，以培养基重悬沉淀的巨噬细胞，接种于6孔培养板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育48 h，应用全自动酶标仪于492 nm波长下检测总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C) 和高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的含量。

1.2.6 AI值的计算：按下述公式计算AI：AI=non-HDL-C/HDL-C，其中non-HDL-C=TC-HDL-C。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 模型组大鼠均成功建立ACS模型，心电图见图1。造模后模型组大鼠生命体征均表现稳定，两组大鼠均精神状态良好，毛发光亮，体重稳定，饮食饮水正常，实验期间均未发生死亡。

2.2 两组大鼠心肌和主动脉组织形态学 HE染色可见模型组大鼠心肌纤维和间质坏死，心肌细胞核呈碎裂或变性状改变，大量炎性细胞浸润，间质水肿；主动脉壁内有大量脂质和钙盐沉积，内膜明显增厚，可见大量泡沫细胞，平滑肌细胞排列紊乱。对照组大鼠心肌组织形态基本正常，可见极少量炎性细胞浸润，心肌细胞胞浆染色均匀；主动脉壁内膜无增厚，未见脂质沉积和泡沫细胞。见图2。

A：对照组心脏；B：模型组心脏；C：对照组主动脉；D：模型组主动脉

2.3 两组大鼠心肌梗死面积比例和易损指数比较 模型组大鼠心肌梗死面积比例和易损指数均显著高于对照组，两组比较差异具有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1 两组大鼠心肌梗死面积比例和易损指数比较

2.4 两组大鼠外周血巨噬细胞中脂质表达水平比较 与对照组比较，模型组大鼠外周血巨噬细胞中TC、TG和LDL-C表达水平均较高，而HDL-C表达水平较低，差异具有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 两组大鼠外周血巨噬细胞中脂质表达水平比较(mmol/L)

2.5 各组大鼠non-HDL-C和AI值比较 与对照组比较，模型组大鼠的non-HDL-C和AI值均较高(均P<0.05)，差异具有统计学意义，见表3。

表3 各组大鼠non-HDL-C和AI值比较

2.6 相关性分析 Pearson相关性分析显示，ACS大鼠AI值与外周血巨噬细胞中TC(r=0.627，P<0.001)、TG(r=0.438，P<0.001)和LDL-C(r=0.699，P<0.001)呈正相关，与HDL-C(r=-0.521，P<0.001)呈负相关，见表4。

表4 相关性分析

2.7 多元线性回归分析 将上述各指标作为自变量、AI值为因变量纳入多元线性回归分析，结果表明，TC(β=0.616，P<0.001)、TG(β=0.215，P<0.001)、LDL-C(β=0.757，P<0.001)和HDL-C(β=-0.255，P<0.001)是AI值的独立影响因素，见表5。

表5 多元线性回归分析

3 讨 论

ACS的病理机制主要为动脉粥样硬化易损斑块的破裂、血栓的形成以及血管痉挛，具有极高的致残率和致死率，是严重威胁患者生命健康的心血管急危重症[6]，因此及早诊断和干预对于ACS的预防和治疗具有至关重要的意义。

本研究采用头部和四肢多点皮下注射盐酸异丙肾上腺素的方法建立了ACS大鼠模型，并以心电图检查确认造模成功。HE染色可见，与对照组大鼠相比，模型组大鼠出现心肌纤维和间质坏死，心肌细胞核呈碎裂或变性状改变，大量炎性细胞浸润，间质水肿；主动脉壁内有大量脂质和钙盐沉积，内膜明显增厚，可见大量泡沫细胞，平滑肌细胞排列紊乱，提示模型组大鼠出现了较为严重的动脉粥样硬化症状。通过计算大鼠心肌梗死面积比例发现，模型组显著高于对照组，同样提示ACS造模成功。易损斑块的稳定性是影响ACS发生发展的重要决定性因素[7-8]，易损斑块的破裂所导致的血栓是ACS发生的病理学基础，易损指数是综合评价动脉粥样硬化斑块稳定性的参数之一，该参数将泡沫细胞和细胞外脂质等脂质成分与平滑肌细胞和胶原纤维等纤维肌性成分相结合，可更为客观、全面的衡量斑块的稳定性[9-11]，本研究中模型组大鼠的易损指数显著高于对照组，提示ACS模型大鼠斑块较为不稳定，可能存在较多的易损斑块。上述结果均提示模型组大鼠出现了典型的ACS症状。

巨噬细胞脂质稳态是指巨噬细胞内脂质含量的动态平衡，当该平衡受外界因素影响或细胞因子的调控而被打破时，尤其是当胞内脂质含量增多时，胞内脂质累积即可引发巨噬细胞泡沫化，而后者为影响ACS发生发展的重要因素之一[12-14]。动物实验发现，高胆固醇饲料喂养的大鼠更易诱发动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)或ACS模型，说明脂质摄取和代谢的稳态在此类疾病的发生发展中发挥了重要作用[15]。另有研究[16]证实，TC和LDL-C的增加，以及HDL-C的减少，导致LDL-C/HDL-C比值的升高，是ACS最基本的致病原因之一。LDL-C一方面可慢性炎症损伤血管内皮功能，和单核细胞进入内皮下被氧化修饰为ox-LDL和巨噬细胞；另一方面，LDL-C可和各类炎症因子、单核细胞等聚集于内皮表面，产生黏附分子和多种细胞因子，进一步加重对内皮功能的损伤，形成恶性循环，从而导致ACS及AS等疾病的发生。随着研究的不断深入，发现冠脉病变与LDL-C的关联并非线性的，极低密度脂蛋白胆固醇(Very low density lipoprotein cholesterol,VLDL-C)在TG≥200 mg/dl时被降解而间接引起LDL-C的升高，被巨噬细胞吞噬而导致巨噬细胞泡沫化，从而促进AS的进程。AI为TC与HDL-C含量的差值除以HDL-C，包含了所有与动脉硬化相关的脂质成分，可反映脂质中危险成分与保护成分的比值，是衡量动脉粥样硬化程度的重要指标[17]。LDL-C已在既往研究[17]中被证实与冠状动脉心脏病的发生密切相关，是冠状动脉病理性改变的重要危险因素之一。然而近年来的研究[18]认为，AI可作为LDL-C小而密的替代性参数，可能成为临床诊断ACS的新型指标之一。

本研究中，模型组大鼠外周血巨噬细胞中TC、TG和LDL-C的表达水平均显著高于对照组，而HDL-C的表达水平显著低于对照组，提示巨噬细胞中脂质的表达动态平衡可能与ACS的发生发展有关；同时，模型组大鼠的non-HDL-C和AI值均显著高于对照组，提示巨噬细胞中脂质的表达水平可能与AI值存在一定关联。进一步的Pearson相关性分析表明，ACS大鼠的AI值与外周血巨噬细胞中TC(r=0.627，P<0.001)、TG(r=0.438，P<0.001)和LDL-C(r=0.699，P<0.001)呈正相关，与HDL-C(r=-0.521，P<0.001)呈负相关；多元线性回归分析结果显示，TC(β=0.616，P<0.001)、TG(β=0.215，P<0.001)、LDL-C(β=0.757，P<0.001)和HDL-C(β=-0.255，P<0.001)是AI值的独立影响因素，进一步揭示了ACS大鼠外周血巨噬细胞中脂质的稳态与AI值密切相关。张海波等[19]的研究同样表明，脂代谢异常与ACS的发生发展密切相关，血栓的形成与TC/HDL-C比值的升高关系密切，ACS患者TC显著升高、HDL-C显著降低，同时AI值显著升高，AI与ACS具有明显的相关性，可作为ACS的独立危险因素之一。金雷等[20]的研究亦证实，冠状动脉心脏病患者的non-HDL-C与AI值呈正相关，将AI与常规生化指标联合应用，可更好的评估冠脉病变情况，为冠状动脉心脏病的及早诊治提供一定的支持。

综上所述，本研究表明，ACS模型大鼠外周血巨噬细胞中脂质稳态与AI密切相关，TC、TG、LDL-C和HDL-C是AI值的独立影响因素。然而，本研究仅揭示了ACS模型大鼠外周血巨噬细胞中脂质的稳态与AI值的关联，其与ACS发生发展的具体作用机制的关系仍有待进一步深入探究。