过表达5-脂氧合酶通路对氧糖剥夺/复氧小胶质细胞增殖、凋亡的影响

周 爽,王 琰,孙光强,史永恒,王 川,王国全,李 敏,王 斌

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

缺血性脑卒中严重危害人类健康，目前使用纤栓剂溶栓是临床首选治疗手段，但重建血流导致再灌注脑损伤，即脑缺血/再灌注损伤(Cerebral ischemic/reperfusion injury,CI/RI)，神经保护治疗则成为应用前景。CI-RI是多种机制参与的一种复杂病理生理过程，研究表明，当脑缺血再灌注发生时，在缺血灶局部存在大量炎症因子，炎症反应是引起脑缺血损伤后再灌注损伤的关键原因之一[1]。因此，通过改善炎症损伤来减轻脑缺血损伤，并可调节炎性因子失衡[2]，研究引起损伤的炎症反应无论是对缺血性脑卒中还是对之后的CI/RI都有着重要意义。脑缺血损伤发生后花生四烯酸含量增加，5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase，5-LOX)作用花生四烯酸代谢衍生白三烯和生物活性物质的产生，这类活性物质将参与中风后的病理生理过程，例如氧化应激和炎症，还可能促成细胞凋亡[3-4]。5-LOX与炎症性中枢神经系统疾病有关，5-LOX的过表达可能促进炎症细胞因子的产生并导致CI/RI后神经元损伤更为严重[5]。

小胶质细胞(Microglia,MG)是脑内的固有免疫细胞，在CI/RI发生后的炎症反应中起重要作用[6]。在脑缺血损伤后期，由于MG被过度激活，激活后的MG表达产生趋化因子和炎性因子，炎性因子聚集在脑缺血损伤部位，进一步加剧脑损伤[7]。随着MG在中枢神经系统中的日益关注，5-LOX通路也被认为参与了中枢神经系统的炎症反应[8-9]，MG中5-LOX通路的下调有助于缺血性脑损伤的恢复，但研究5-LOX，其最大的特点是能够在体内外转染分裂和非分裂的细胞，是一种具有自我失活功能、无免疫反应的高效基因传递工具。并且具有容纳外源目的基因，可将所携带的目的基因整合到宿主染色体中并稳定长期表达、随亲本的繁殖将外源基因传递给子代发挥作用等优点[10]。为根据慢病毒载体技术的进展，提高效率和生物安全性的载体设计，进一步研究5-LOX途径在CI/RI中作用机制。通过建立5-LOX过表达氧糖剥夺/复氧(OGD/R)BV2细胞模型，研究5-LOX在脑缺血炎性损伤中神经保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞与质粒来源：BV2小鼠MG系购自CTCC。pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro质粒和293T细胞购自天津赛尔生物技术有限公司。脂质体Lipofectamine2000 Reagent购自Invitrogen(美国)。

1.1.2 主要试剂与仪器:LB培养基(Sigma，美国)，B型质粒小量快速提取试剂盒(博大泰克，北京)，XL1-Blue，EB(Ethidium Bromide北京鼎国，北京)，限制型内切酶EcoRI，BamHI和dNTP (10 mmol/L)(Takara，日本)，T4 DNA ligase(Promega，美国)，无血清培养基Opti-MEM(Invitrogen,美国)。L420型台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，PTC-200型热循环仪(Bio-Rad,美国)，CO2恒温培养箱(Thermo Forma,美国)，5415D型离心机(Eppendorf,德国)，DK-8B型电热恒温水槽购自(上海精宏实验设备有限公司)，倒置显微镜和96孔培养板(OLYMPUS,日本)。

1.2 研究方法

1.2.1 BV2细胞培养：BV2细胞是小鼠小胶质细胞株，使用DMEM完全培养基(含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素与100 μg/ml链霉素)在二氧化碳培养箱(5%CO2，37 ℃条件)中培养、传代。

1.2.2 BV2细胞感染过表达5-LOX病毒/对照病毒： pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro质粒载体(图1)。将Alox5序列信息序列直接合成至pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro载体上。复苏并培养的293T细胞，给予DMEM完全培养基。在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养293T细胞，培养过程中，每24 h换液，传代比例为1∶5～1∶10。将pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro质粒载体转染293T细胞进行慢病毒包装，收集上清液，浓缩制成病毒颗粒，同样方法构建空载体病毒。病毒颗粒感染BV2小胶质细胞，G418进行细胞致死率筛选，挑选稳定转染的单克隆抗体细胞株。我们将G418药物设置4个浓度梯度来细胞致死率的浓度筛选，浓度设置分别为200、300、400 μg/ml、500 μg/ml。细胞大量死亡出现在第3天到第8天中，除去死亡细胞，收集活下来的细胞形成单克隆，并将感染后的细胞转至96孔板，继续培养。

图1 pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5质粒

1.2.3 建立OGD/R 5-LOX过表达BV2细胞模型:5-LOX过表达的BV2细胞在完全培养基中培养，收集第三代细胞，胰蛋白酶将BV2细胞从培养瓶中消化下来，BV2细胞制成悬液。调整细胞密度，将细胞再次接种于细胞培养板中，细胞中的完全培养液更换为无糖Earle’s液，利用三气培养箱37 ℃下(94%氮气、5%二氧化碳、1%氧气)建立缺氧缺糖模型。在氧糖剥夺实验中，BV2细胞分为5-LOX病毒过表达组与CON空病毒载体组，氧糖剥夺分别0、1、2、4 h，复氧12 h，根据显微镜下拍摄OGD处理0、1、2、4 h的细胞形态，确立OGD/R 5-LOX过表达BV2细胞模型。

1.2.4 细胞给药及分组:BV2细胞5-LOX过表达组与空载体对照组给予齐留通(Zileuton)、孟鲁司特(Montelukast)、U75302被用来分别阻断5-LOX，CysLTR1和BLT1通路。将细胞分为以下10组，正常组按照常规细胞培养方法，给予完全培养液，并不进行OGD/R的处理。5-LOX过表达组给予5-LOX过表达病毒转染；除空白组外其他组均进行缺糖缺氧/复氧处理，给药组分别给予Zileuton、Montelukast、U75302处理。见表1。

表1 实验分组与给药

1.2.5 MTT检测OGD/R5-LOX过表达BV2细胞的细胞活性：按照实验分组将细胞接种与96孔板上，除空白组外，均进行OGD/R处理细胞，进行细胞活性检验，除设空白孔外，空载体与5-LOX过表达10个分组，分别各设置3个复孔，分别向每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，放置于(37 ℃，5%CO2)培养箱继续培养4 h，弃去培养液，PBS冲洗，每孔加入150 μl DMSO溶解沉淀。酶标仪将波长设置为570 nm，测出各孔的吸光度值。抑制率=[(对照组-实验组)/对照组]×100%。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡：将空载体与5-LOX过表达10个分组的各组细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液混匀，室温避光20 min，将避光后的细胞置于冰水混合物中，使用流式细胞仪进行检测。PI荧光信号值用纵坐标表示，Annexin-V-FITC荧光信号值表示为横坐标。碘化丙啶染色对正常细胞是无法染色的，LR区域属于细胞膜完整，PI染色。UR区域中的细胞膜破裂，PI和Annexin-V-FITC均可染色。

2 结 果

2.1 全基因合成pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5质粒测序结果比对 结果显示(图2)，Alox5测序结果比对结果显示，pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5质粒全基因合成成功。

图2 pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5质粒

2.2 5-LOX过表达转染后对BV2细胞形态的影响 细胞形态结果见图3。与空载体对照组氧糖剥夺0 h对比，空载体对照组氧糖剥夺1、2、4 h后细胞数目逐渐减少，细胞形态改变，空白组细胞形态完整，呈现梭形。空载体对照组OGD后细胞逐渐形成“阿米巴状”，5-LOX过表达则增加细胞损伤，给药组分别能减缓细胞的“阿米巴状”。根据前期实验，氧糖剥夺复氧时间，由细胞生长状态改变，我们选取缺氧4 h复氧12 h为脑缺血体外模型。

图3 缺氧不同时间各组细胞形态(PI染色，×200)

2.3 OGD/R 5-LOX过表达对BV2细胞增殖影响 缺氧2 h复氧12 h处理条件下,检测5-LOX过表达的小胶质细胞活力，实验分组同1.2.4。第1组和第6组是未经过OGD/R处理的空白对照组，第2组是空载体OGD/R模型组，第7组是5-LOX过表达OGD/R模型组。空载体对照病毒OGD/R组与空白组相比活力降低，空载体对照组给予Zileuton(第3组)、Montelukast(第4组)、U75302(第5组)后，与OGD/R空载体对照组对比，给通路阻断剂后，细胞活力较对照组有一定提高，且U75302活性优于Montelukast。病毒空载体模型组(第2组)与5-LOX过表达病毒模型组(第7组)对比，5-LOX过表达后细胞活力下降，同样给予Zileuton、Montelukast、U75302组的细胞活性比5-LOX病毒过表达OGD/R模型组(第7组)高，5-LOX过表达Zileuton(第8组)与Montelukas(第9组)对细胞的保护作用基本接近，U75302(第10组)高于Zileuton(第8组)与Montelukas(第9组)。

2.4 OGD/R 5-LOX过表达对BV2细胞凋亡的影响 实验分组同1.2.4。流式细胞仪检测结果显示，在空载体对照病毒中，空白组(第1组)与模型组OGD/R(第2组)对比，OGD/R后细胞的凋亡明显升高，给予Zileuton(第3组)、Monteluka、U75302(第5组)能够减弱凋亡，空载体病毒Zileuton(第3组)明显降低细胞凋亡，接近空白(第1组)，Montelukas(第4组)与U75302(第5组)降低细胞凋亡与模型组OGD/R对比差异有统计学意义(均P<0.05)。5-LOX过表达与空病毒空白组对比后，过表达的5-Lox病毒对细胞凋亡增加较小。模型组与空白组对比均具有统计学差异(P<0.01)，给药组与模型组对比均具有统计学差异(P<0.01)。

空病毒对照组中，UR和UL区域细胞染色都是0%，在LL区域99%，细胞膜完整，LR区域0.86%，表示仅有极少凋亡细胞；空病毒组OGD/R后，细胞分别在UR区域0.221%，UL区域0.412%，细胞膜破裂，膜内磷脂酰丝氨酸被染色；在空病毒Zileuton组，细胞集中LL区域，UL与UR区域0%，仅有LR区域1.44%的凋亡细胞；空病毒Montelukast组中UL与UR区域0%，LR区域凋亡细胞2.73%；空病毒U75302组中，UL区域0.021%，UR区域0.126%，LR区域2.56%，与Montelukast、Zileuton组对比，U75302组中细胞死亡和细胞壁破裂较多。5-LOX病毒过表达对照组中，UR区域0%，LR区域0.087%，在LL区域90.6%的细胞膜完整，LR区域9.32%，与空载体对照组相比，5-LOX过表达后，细胞膜破裂出现，细胞出现死亡和晚期凋亡；空病毒组OGD/R后，细胞分别在UR区域1.48%，LR区域10.9%，细胞凋亡与死亡进一步增加；5-Lox过表达Zileuton组，细胞4个区域具有分布，UL:0.153%，UR:0.123%，LR:2.56%，细胞凋亡得到改善；5-LOX过表达U75302组中，UL:0.021%，UR:0.126%，LR:2.56%，与Zileuton组对比，U75302组中UR和UL区域细胞染色都是0%，在LL:97.1%，LR:2.87%，表示仅有极少凋亡，细胞死亡和细胞壁破裂减少。

3 讨 论

CI/RI后引起继发性损伤，炎性反应的发生不但与MG等中枢神经系统免疫细胞活化有关[11]，损伤发生后小胶质细胞迅速活化，变成具有吞噬能力的“阿米巴状”，同时释放大量细胞因子和炎症介质，会引起继发性脑损伤。5-LOX属于一类称为脂氧合酶的酶，可氧化游离和酯化的多不饱和脂肪酸。5-LOX作用花生四烯酸代谢衍生白三烯，生成白三烯A4(LTA4)，LTA4通过其酶促反应转化为白三烯B4(LTB4)和白三烯C4(LTC4)[12-13]。LTB4受体可分为BLT1和BLT2，LTC4可生成半胱氨酸白三烯受体CysLT1和CysLT2，它们可以识别白三烯LTD4、LTD4、LTE4和LTF4。实验结果得出5-LOX过表达增加细胞损伤。以5-LOX过表达病毒转染BV2细胞的手段，通过显微镜拍照观察，在不同缺糖缺氧时间中，细胞形态损伤变化情况。并根据细胞形态，筛选缺糖缺氧复氧模型的时间。BV2细胞采用OGD/R模型，模拟脑缺血再灌注损伤。基于前期对BV2的缺氧实验研究发现，在脑缺血损伤后，BV2被激活，细胞炎性因子增加。本次实验发现缺氧超过4 h就会对BV2的生长造成一定影响，缺氧1 h对细胞影响不大，但也不能很好的造成氧糖损伤模型，缺氧6 h后，细胞呈现“阿米巴状”较多，且BV2细胞的数量减少，细胞存活率下降。实验组最终确立模型时间为缺氧缺糖4 h，复氧12 h模型。

Zileuton作为5-LOX的抑制剂，它可有效地衰减在PC12细胞中的MG介导的鱼藤酮毒性[14]。在实验研究中，5-LOX上调在低氧血症患者的大脑皮层中，5-LOX在MG表达中升高[15]。这些结果表明5-LOX途径与MG炎症引起的神经元死亡有关。LTB4和CysLT1和CysLT2是主要的促炎介质，5-LOX途径在许多疾病中均被激活引起炎症反应[16]。研究发现CysLTs在各种神经调节过程具有重要调节作用，CysLTs及其受体与多种神经退行性疾病相关，例如多发性硬化症，帕金森氏病，亨廷顿氏病，癫痫和阿尔茨海默氏病[17]。抗白三烯药物分为两类：CysLT受体拮抗剂(扎鲁司特，普仑司特和孟鲁司特Montelukast)和LTs抑制剂(5-脂氧合酶抑制剂，例如齐留通Zileuton，ZD2138，BayX1005和MK-0591)。白三烯B4(LTB4)参与多种疾病中发生的炎症，U75302是BLT1受体拮抗剂，LTA4水解酶是LTB4生产中的限速酶，拮抗剂的使用均可以降低炎性反应[18-19]。选择性5-LOX抑制剂Zileuton和CysLTR1拮抗剂Montelukast可减轻胶质细胞的炎性损伤提高细胞活力[20]。U75302是LTB4的受体阻断剂，使用U75302阻断LTB4/BLT1信号通路已被用于缓解各种炎症和线粒体功能障碍[21]。Montelukast是白三烯的受体抑制剂，它可以降低LPS刺激的人类嗜中性粒细胞活化，同时减轻急性呼吸窘迫综合征(ARDS)小鼠模型的炎症[22]。

综上所述，通过探索5-LOX通路在氧糖剥夺/复氧小胶质细胞，我们发现过表达的5-LOX可以介导小胶质细胞OGD/R的损伤和激活。在OGD/R诱导的脑缺血损伤中，5-LOX激活是通过5-LOX过表达介导的BV2细胞中CysLTRs/CysLTs和LTB4/BLTs途径的氧化应激介导的，这一结果能够为脑缺血/再灌注损伤的诊断和临床治疗提供分子基础[23]。