阿克苏地区传统酸乳中乳酸菌筛选及安全性初步评价

林 杨, 顾美英 , 孙 建, 唐琦勇, 李 雪, 朱 静, 古丽尼沙·沙依木, 张志东,2*

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所 新疆特殊环境微生物重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830091;2.新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是指利用碳水化合物发酵，可产生大量乳酸的细菌统称[1]，主要为革兰阳性细菌，其广泛分布于自然界中[2]，对动、植物和人类的正常生理代谢发挥了重要的作用[3]，可广泛用于食品、医药及农业生产等领域。新疆是畜牧业大省，因传统习俗和饮食文化，多个民族具有食用发酵乳制品的悠久历史，存在风味不一、极具各民族特色的传统发酵乳制品，如酸马奶、奶豆腐、稀奶油、奶疙瘩等，蕴藏着丰富的乳酸菌资源。然而，随着工业化乳酸发酵剂的大量使用，使得传统发酵工艺受到严重冲击，导致部分具有优良性状的菌株流失。因此，加大相关传统发酵乳制品中乳酸菌资源的挖掘和评价，有着重要的科学研究意义。近年来，许多学者从新疆各地区的传统乳制品中分离获得多种乳酸菌资源，均表现出良好的生产特性和应用价值。如蔡静静等[4]从新疆伊犁地区的传统乳制品中，筛选出具有良好产酸及产香的乳杆菌，并以此为发酵剂，研制出了特性好、风味佳的发酵乳；高云云等[5]从新疆塔城地区的酸马奶等乳制品中筛选出3株高产胞外多糖的植物乳杆菌，其中菌株1-3展现出较强的肠道定殖、降胆固醇能力和胆盐耐受性等益生特性，可作为潜在益生菌应用于功能性产品的开发。此外，还有学者针对阿克苏拜城县的传统发酵酸奶进行乳酸菌的分离筛选，获得的部分菌株具有良好的产多糖、产香等发酵特性及益生特性。新疆阿克苏托木尔峰国家级自然保护区位于阿克苏地区温宿县北部，与吉尔吉斯斯坦相接壤，其周边世代生活着维吾尔族、柯尔克孜族等牧民，保存着历史悠久的常温自然发酵酸奶的传统工艺，其相关乳酸菌资源目前鲜有报道，有待深入挖掘。 本研究通过对托木尔峰自然保护区周边村镇传统发酵酸乳进行收集，分离筛选相关乳酸菌，并对菌株的生长特性、益生功能及食用安全性进行研究，为进一步筛选益生效果好、食品安全的乳酸菌资源，并对其开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 ①传统酸乳：2020年6月采自阿克苏地区苏托木尔峰自然保护区周边村镇，由柯尔克孜族村民采用传统工艺常温自然发酵而成。②指示菌：大肠埃希菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、青霉菌(Penicillium)和黑曲霉(Aspergillusniger)菌株，均由新疆微生物资源保藏管理中心(Microbiological Culture Collection Center of Xinjiang，MCCCX)提供。③抗生素滤纸片：青霉素10 IU/片、红霉素15 μg/片、四环素30 μg/片、链霉素10 μg/片、庆大霉素10 μg/片、卡那霉素30 μg/片、诺氟沙星10 μg/片、氨苄西林10 μg/片、利福平5 μg/片、万古霉素30 μg/片，购自北京天坛生物制品股份有限公司。

1.1.2 培养基 ①MRS培养基、R2A培养基、LB液体培养基、乳糖胆盐培养基和哥伦比亚血琼脂培养基，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；②功能酶定性培养基：在R2A培养基中分别加入1%(质量分数)的脱脂牛奶、可溶性淀粉、果胶、吐温-80、羧甲基纤维素钠制备而成；③生物胺检测培养基：牛肉膏5.0 g，胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖0.5 g，柠檬酸铵2.0 g，氯化钠2.5 g，磷酸氢二钾2.0 g，吐温-80 1 mL，硫酸镁0.2 g，碳酸钙0.1 g，硫酸亚铁0.04 g，硫酸锰0.05 g，维生素B10.01 g，5-磷酸吡哆醛0.05 g，溴甲酚紫0.06 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值5.8～6.0；④改良氨基脱羧酶检测培养基：分别在生物胺检测培养基中加入10 g/L的对应前体氨基酸(精氨酸、酪氨酸、尸氨酸、色氨酸、组氨酸)，制备而成；⑤硝基还原酶检测培养基：蛋白胨10 g，硝酸钾1 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.4左右；⑥蛋白胨水培养基：蛋白胨20 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.4～7.6。

1.1.3 仪器与设备 超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)；生化培养箱(SPX-250BF，上海福玛实验设备有限公司)；立式冷藏柜(SC-316，海尔HAIER公司)；自动高压灭菌锅(HVE-50，日本HIRAYAMA公司)；紫外分光光度计(UVZ2550，日本岛津仪器公司)；PCR仪(ABI 2720，赛默飞世尔科技有限公司)；光学显微镜(CH20BIMF200，日本Olympus有限公司)；高速冷冻离心机(PLCD，德国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离筛选 无菌条件下，采用标准梯度稀释法，分别取1 mL酸乳样品置于9 mL生理盐水中，混匀，依次稀释至10-5。分别取各浓度样品稀释液100 μL，均匀涂布于含有1%(质量分数)CaCO3的MRS平板上，37 ℃培养48 h。挑取有溶钙圈的菌落，划线纯化后，转接至MRS固体斜面，37 ℃培养48 h，置于4 ℃保存，备用。

1.2.2 菌株的分子鉴定 挑取少量新鲜的单菌落菌苔，并以此为PCR扩增模板，利用细菌16S rRNA基因序列PCR扩增通用引物(27 F和1492 R)，进行16S rRNA基因序列的扩增[6]。PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后，送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序。在EzTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/)中，进行菌株的16S rRNA基因序列比对，并下载相似性最高的模式菌株序列，使用MEGA 7.0进行ClustalX多重比对，并构建Neighbor-Joining系统发育树，初步确定菌株分类地位。

1.2.3 菌株的生长特性 菌株的适宜生长温度、耐盐特性和起始pH均采用MRS液体培养基为基础培养基进行，胆盐耐受性在含0.5%(质量分数)猪胆盐的乳糖胆盐培养基上进行；牛奶胨化试验参照《常见细菌系统鉴定手册》[7]进行。

1.2.4 菌株的功能性酶活 将斜面保存的乳酸菌菌株于MRS平板活化2～3代后，采用点接法，用无菌竹签分别将各菌株接种至果胶酶筛选培养基、酯化酶筛选培养基、淀粉酶筛选培养基、纤维素筛选培养基等待测培养基上，30 ℃培养3～5 d，分别测量菌落周围的透明圈直径和菌落直径，并以HC值(透明圈直径/菌落直径)判断各菌株的产酶能力。其中，可直接观察菌落周围的透明圈筛选蛋白酶、果胶酶和酯化酶；用0.1%(质量分数)的碘液染色后观察透明圈，筛选淀粉酶；用0.1%(质量分数)的刚果红染色后观察透明圈,筛选纤维素酶[8]。

1.2.5 菌株的抗氧化活性 将乳酸菌菌株接种至MRS液体培养基中，30 ℃，150 r/min培养48 h后，取10 mL发酵菌液，4 000 r/min、4 ℃离心15 min，得到发酵上清液，并参照李权威等[9]和张莹[10]的方法，于室温测定各菌株上清液的DPPH自由基和羟基(OH-)自由基清除能力。每组试验各重复3次，以1 mg/mL的维生素(VC)作为对照。

1.2.6 菌株的抑菌活性 分别挑取新鲜培养的指示菌株大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌，接种于LB液体培养基中，30 ℃、120 r/min振荡培养16 h。取100 μL发酵菌液，均匀涂布于MRS固体培养基。待上述菌液平板吸收后，将乳酸菌菌株点接于划定区域中心，30 ℃培养48 h，观察菌株抑菌圈情况。青霉菌、黑曲霉则用无菌生理盐水制成的孢子悬液涂布于平板，点接乳酸菌菌株，培养48 h后，观察菌株抑菌圈情况。

1.2.7 菌株药敏性评价 乳酸菌菌株于MRS液体培养基活化过夜，3 000 r/min离心10 min后弃去上清液，菌体重悬于无菌生理盐水中，并调整菌体浊度为0.5麦氏单位。分别取100 μL菌悬液，均匀涂布于MRS固体培养基，待菌液被平板吸干后，将药敏纸片贴于培养基表面，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径，并记录结果。

1.2.8 菌株的溶血性测定 取活化后的乳酸菌菌株，接种于哥伦比亚血琼脂平板上，37 ℃培养48 h，观察菌落周围溶血情况。菌落周围形成透明的溶血环，为β-溶血；菌落周围形成草绿色环，为α-溶血；菌落周围没有变化，为γ-溶血，即不溶血。金黄色葡萄球菌在相同条件下培养，作阳性对照。

1.2.9 菌株有害代谢物质检测 ①生物胺的测定[11]：将活化后的乳酸菌菌株分别在改良氨基脱羧酶检测平板和未添加前体氨基酸的平板上划线，37 ℃培养并观察颜色变化，变为紫色的为阳性，否则为阴性。试验以接菌在未添加前体氨基酸的平板(CK)为对照。②吲哚试验[12]：以2%(体积分数)乳酸菌菌悬液接种于蛋白胨水培养基中，37 ℃培养48 h，滴加吲哚试剂，液面出现玫瑰红色则为阳性，否则为阴性。试验以大肠埃希菌为阳性对照，以不接种乳酸菌菌液的蛋白胨水培养基为空白对照。③硝基还原酶活性检测[13]：以1%(体积分数)乳酸菌菌悬液接种于硝基还原酶检测培养基中，37 ℃恒温培养72 h，依次向乳酸菌发酵培养液中加入α-萘胺溶液和对氨基苯甲磺酸溶液，观察培养基颜色的变化。以大肠埃希菌为阳性对照，未接种菌株的硝基还原酶检测培养基为空白对照。

1.2.10 统计分析 试验数据采用Microsoft Excel 2010、MEGA 7.0、Origin 8.0等数据处理系统进行整理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选和分子鉴定

从采集的8种传统酸奶中共分离挑选细菌35株，酵母菌3株。将其中的细菌转接至含有1% CaCO3的MRS培养基培养，观察菌落形态和透明圈大小，初步筛选出12株疑似乳酸菌株，经革兰染色、镜检，初步确定6株疑似乳酸菌。

将6株菌的16S rRNA基因序列与EzTaxon数据库(http://www.ezbiocloud.net/)中模式菌株进行比对，并构建系统发育树(图1)。结果表明，6株菌均为乳酸菌，分属于肠球菌属(Enterococcus)、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、链球菌属(Streptococcus)。分别编号为乳酸菌菌株Z6-4、Z6-9、Z6-11、Z8-1、Z8-5、Zp-1。

图1 基于菌株16S rRNA基因序列构建的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of strains based on the 16S rRNA gene sequences

2.2 菌株的生长特性

菌株的生长特性(表1)表明，6株乳酸菌均能耐受5%(质量分数)的NaCl，其中5株可在45 ℃正常生长，显示出较强的耐温及耐盐特性；6株乳酸菌菌株均在起始pH 3.0时不生长，而pH为4时，菌株Zp-1和Z8-5生长较好。6株乳酸菌均可在0.5%(质量分数)猪胆盐培养基上正常生长，表现了良好的耐酸、耐盐和耐胆盐特性，有利于其在肠道中定殖。6株乳酸菌菌株均具有良好的胨化能力，无乳清析出；其中菌株Z6-9、Z8-5和Zp-1发酵牛奶香气浓郁，酸乳柔和细腻，可作为乳制品工业中的潜在生产菌株。

2.3 菌株的功能性酶活

通过透明圈法对各菌株的产酶特性进行分析(表2)，发现6株乳酸菌菌株可不同程度的代谢产生常见的食品工业酶，6株菌均产蛋白酶，其中4株活性较强；3株可产生淀粉酶，3株可产生果胶酶，当酸乳加工和食用时，这些酶可较好地酶解食物中大分子蛋白，协助催化淀粉和果胶类食品分解，使之更容易消化吸收。但6株乳酸菌菌株的酯化酶和纤维素酶活力较差，均不产生纤维素酶，仅菌株Z8-5可产酯化酶。

表1 菌株的生长情况

表2 菌株功能性酶活

2.4 菌株的抗氧化活性

菌株发酵上清液中的代谢产物对DPPH、OH-自由基的清除能力见图2。由图2可知，6株乳酸菌菌株的代谢产物对不同的自由基表现出不同程度的清除能力，其中菌株Z8-5和Zp-1发酵液对两种自由基的清除率均在80%以上，清除能力较好；总体来说，6株乳酸菌菌株对OH-自由基的清除率较DPPH自由基略好，菌株Z6-9和Z8-1的清除能力分别达96%和90%，与1 mg/mL VC清除OH-自由基的能力接近，而菌株Zp-1的清除率最低，仅为36%。除菌株Z6-4外，其余菌株对DPPH自由基的清除率差别不大，在77.5%～84.1%之间。

2.5 菌株的抑菌活性

抑菌性试验(表3)表明，6株乳酸菌菌株对常见的肠道致病菌均有不同程度的抑制作用，对大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌均有抑制作用，而菌株Z6-9和Zp-1的抑制作用最强；4株对金黄色葡萄球菌有抑制作用，其中Z8-5和Zp-1的活性较强，但对霉菌和酵母菌均没有抑制作用。一般而言，多数乳酸菌代谢产生细菌素，可对亲缘关系相近的革兰阳性细菌有较好地抑制作用，而本研究中多数菌株对大肠埃希菌同样表现出较强地抑制作用，表明本研究中的乳酸菌除代谢细菌素外，可能还代谢其他抑菌物质，有待进一步分析。

图2 菌株发酵液对DPPH自由基、羟基(OH-)自由基清除能力Fig.2 DPPH and hydroxyl (OH-) free radical scavenging activity of metabolites from strainss

表3 菌株的抑菌活性

2.6 菌株药敏性评价

选取10种常见抗生素进行菌株的耐药性评价，结果显示(表4)，6株乳酸菌菌株对抗生素呈现出不同的药敏性。其中，所有菌株对红霉素、氨苄西林和利福平具有敏感性，有5株菌株对万古霉素敏感。诺氟沙星抑菌效果最差，除菌株Z6-4和Z8-5外，其他菌株均对其具有耐药性。此外，研究发现菌株Z6-4对试验抗生素均表现出药敏性。本研究中，乳杆菌属和肠球菌属对四环素、红霉素、利福平等表现出较强的耐受性，这一结果与许女等[14]和张在等[15]对乳杆菌和肠球菌的研究结果一致。一般而言，耐药性较强的菌株在肠道定殖后，有利于耐受各种原因服用的抗生素等药物，从而更长久地发挥其益生作用[16]，但也带来了耐药性基因转移的风险。

表4 菌株抗生素敏感性

2.7 溶血性测定

菌株分泌的溶血素能够溶解细胞，使机体引发红细胞内在缺陷、抗原抗体反应等，从而导致败血症，这与菌株自身所携带的致病性基因有关，溶血性是评价乳酸菌安全性的重要指标之一[17]。溶血试验结果如图3所示，6株乳酸菌菌落周围既无草绿色环也无透明圈，属于无毒性的γ-溶血，表明菌株不具有引发败血症的隐患。

2.8 有害代谢物质检测

6株乳酸菌菌株的有害代谢物质检测结果如表5所示，菌株Z6-4和Z6-11在添加了L-酪氨酸、L-色氨酸和L-组氨酸的平板上，呈现阳性结果，说明其具有产胺能力，分别能够将前体氨基酸转化为酪胺、色胺和组胺，而其余菌株则均为阴性结果，不具有生物胺产生能力。吲哚检测表明，菌株Z6-11、Z8-1、Z8-5和Zp-1发酵液的液面颜色均为轻微的玫瑰红色，结果呈弱阳性；在硝基还原酶试验中，6株乳酸菌株均不产生硝基还原酶。

图3 菌株的溶血试验结果Fig.3 Hemolysis test results of strainsA：6株乳酸菌菌株；B：金黄色葡萄球菌A: Six Lactic acid bacteria were tested; B:Staphylococcus aureus

表5 菌株的有害代谢物质检测

3 讨 论

新疆地域广阔，伊犁、阿勒泰、喀什、阿克苏等地区少数民族均有利用马乳、牛乳、骆驼乳、羊乳等发酵自制乳制品的习俗，经过长期自然驯化，保留了优良特性的土著乳酸菌[18-20]。近年来，多数学者从新疆伊犁、喀什等地的传统奶酪[21]、泡菜[22]和酸奶[23]中分离筛选获得多种乳酸菌，且部分菌株具有良好的胃肠道耐受性和产酸、抑菌等益生特性。新疆阿克苏地区作为古丝绸之路的重要驿站，乳制品种类繁多，尤其是阿克苏拜城县赛里木酸奶，又称“拉丝酸奶”，具有颜色乳白、气味清香、有弹性、酸甜可口，且质地黏稠的特点[24]。南京农业大学[25]、塔里木大学[26]等先后对赛里木酸奶中菌株组成和酸奶营养组分进行了分析，分离出了瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)，其中乳杆菌为优势菌属，并推测GABA和油酸、亚油酸可能是赛里木酸奶中重要功能因子。但对获得的菌株的食用安全性鲜有相关评价。

新疆阿克苏托木尔峰国家级自然保护区，位于新疆维吾尔自治区阿克苏地区温宿县北部与吉尔吉斯斯坦相接壤，属现代冰川、山地、荒漠、草原、森林混合生态系统。其周边世代生活着维吾尔族、柯尔克孜族等牧民，保存着历史悠久的常温自然发酵酸奶的传统工艺，此前少有研究。本研究对该地区周边牧民农户进行了酸奶收集，获得了8个代表性样品，并开展了乳酸菌的分离筛选，获得6株乳酸菌，经16S rRNA序列分析，确定其隶属于肠球菌属(Enterococcus)、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、链球菌属(Streptococcus)，其中肠球菌属分离菌株最多，这可能是因当地的气候、海拔、传统制作工艺等不同，造成菌株的分布具有一定的差异[27]。相关资源有待进一步挖掘。

本研究获得的乳酸菌均表现出较好的逆境适应性和良好的抗氧化特性，所有菌株对大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌均有抑制作用，且各菌株均可不同程度地表现出食品酶活及优良的益生作用。抗生素的药敏性分析表明，6株乳酸菌株呈现出不同的药敏特性。一般认为，乳酸菌分离自传统发酵食品或动物肠道中，具有食品安全性(Generally recognized as safe，GRAS)[28]，具有良好耐药性的菌株能够抵抗外来药物的干扰，从而更好地定殖于肠道中发挥益生作用。然而，随着抗生素滥用，部分乳酸菌表现出抗药性增加和抗性基因潜在转移[29]，其相关影响有待长期动物体内试验观察。

安全性分析表明，试验所用的6株乳酸菌菌株均不溶血，且不具有硝基还原酶产生能力；部分菌株可代谢产生生物胺。相关报道显示，能够产生物胺的乳酸菌主要包括部分乳杆菌、肠球菌和片球菌等[30]，而本研究中的链球菌属菌株Z6-11同样具有产生物胺能力，与目前报道较为不同，由此可以看出，产生物胺的乳酸菌并无种属特异性。生物胺可同药物联合治疗疾病，且在动植物的生长发育过程中发挥着不可替代的作用[31-32]；然而当遇到亚硝酸盐存在时，可生成致癌物质[33]，本研究中的乳酸菌菌株均不具有硝基还原酶，其生物胺的产生可能发挥益生作用。同时，本研究中部分菌株在吲哚试验中呈弱阳性，而吲哚作为抗炎、解热及镇痛等药剂的主要成分，在动物健康中扮演了重要角色，具有重要的生物学及生态学双重意义[34]。因此，相关菌株的生物安全性仍需进行动物体内试验，以便做出进一步评价。