香菇液体发酵高产多糖菌株筛选

徐 冲， 冯 敏*， 柴林山， 李剑梅， 张疏雨， 陈 杰， 郭玲玲, 陈丽媛, 王立飞

(1.辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000；2.辽宁省现代农业生产基地建设工程中心，辽宁 沈阳 110033)

香菇(Lentinulaedodes(Berk.)Pegler)又名花菇、香蕈、冬菇，属层菌纲、担子菌亚纲、伞菌目、口蘑科[1]。香菇肉质肥嫩，味道鲜美，香味独特，受到广大消费者喜爱，同时富含多种营养物质，如多糖、蛋白质、嘌呤、氨基酸以及多种不饱和脂肪酸和矿质元素[2-4]，其中香菇多糖为主要活性成分，其以β-(1-3)葡萄糖残基为主链，β-(1-6)葡萄糖残基为侧链，单糖主要包括葡萄糖、甘露醇和半乳糖[5]。香菇多糖具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等功能，并广泛应用于食品、医药等领域[6-8]，从香菇子实体中直接提取多糖不仅周期长，且成本高，而利用液体发酵方法生产香菇多糖已成为行业普遍采用的方法[9-11]，香菇多糖的液体发酵培养研究主要以优化发酵条件和筛选选育高产多糖菌株为手段，而选育高产多糖菌株是基础，高产香菇多糖菌株主要通过自然筛选[9，12]、杂交育种[13]、诱变筛选[14-15]等方法获得。本研究通过对采集自长白山的6株野生香菇菌株和2株实验室保藏的人工栽培菌株，进行发酵培养产多糖性能筛选研究，旨在为生产香菇多糖提供优质菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 6株通过组织分离自长白山的野生香菇菌株，编号分别为CB0901、CB0902、CB0903、CB0904、CB0905、CB0906；2株为人工栽培菌株，编号分别为L06、F0912。8株香菇菌株均由辽宁省微生物科学研究院食用菌育种研究室提供。

1.1.2 培养基[10]①固体培养基：PDA培养基；②液体发酵培养基：马铃薯100 g去皮煮沸15 min过滤，滤液中加入葡萄糖20 g，酵母膏4 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，加水定容至1 000 mL， pH自然，以500 mL三角瓶装液量100 mL进行分装，121 ℃灭菌30 min。

1.1.3 试剂与仪器 葡萄糖、酵母膏、MgSO4、KH2PO4、浓硫酸、苯酚(分析纯)。超净工作台(VS-1300L-U，苏州安泰)；电子天平(ME104E，上海梅特勒-托利多)；高压灭菌锅(LD2F-75L，上海申安)；多功能酶标仪(1510-03055，美国Themo Fisher公司)；高速离心机(Hico21，上海生工)；恒温摇床(SPH2102，上海世平)；生化培养箱(SPX-450，北京中仪国科)；电热鼓风干燥箱(101-2BS，天津宏诺)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养 无菌条件下将菌株接种于PDA平板中央，25 ℃恒温避光培养7～10 d,待菌丝长满平板后，用打孔器取直径0.5 cm菌丝块接入500 mL液体发酵培养基，160 r/min，25 ℃避光培养6 d得种子液，按照10%(体积分数)接种量接入液体发酵培养基中，160 r/min，25 ℃避光培养，分别设置7、10、14 d时结束发酵，每个试验3个重复。

1.2.2 菌丝生物量及胞内多糖含量测定 各菌株按1.2.1培养至相应天数，收集发酵液8 000 r/min离心20 min去上清液，得到菌丝体，蒸馏水洗涤3次，冷冻干燥后称得菌丝体生物量。取3个重复平均值，单位g/L。将冻干后的菌丝体研磨成粉末，并称取50 mg加入50 mL容量瓶中，沸水浴中提取3 h,冷却至室温后定容混匀，8 000 r/min离心20 min,取上清液，苯酚硫酸法测定总糖含量[16]，3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量[17]，胞内多糖含量=总糖-还原糖。

1.2.3 胞外多糖得率及多糖含量测定 取1.2.2中的上清液，缓慢加入4倍体积无水乙醇，搅拌均匀，4 ℃静置醇沉12 h，8 000 r/min离心20 min，收集沉淀以无水乙醇洗涤2次，收集沉淀物，冷冻干燥得胞外多糖，称重计算得率。采用苯酚硫酸法测定其多糖含量。

2 结果与分析

2.1 不同发酵时间各菌株菌丝体生物量比较

对各菌株菌丝体生物量进行比较，结果显示各菌株菌丝体生物量存在较大差异(图1)，各菌株随着培养时间的延长菌丝体生物量均有不同程度的增加。培养至第7天时，菌株CB0901、CB0902和CB0903的菌丝体生物量分别达到8.42、6.09和7.18 g/L，显著高于其他5株菌株。与培养第7天相比，培养至第14天时，菌株CB0901菌丝体生物量最高，为14.76 g/L，提高幅度也最大；菌株CB0903次之，菌丝体生物量为13.77 g/L；菌株CB0902菌丝体生物量为10.56 g/L。这3株菌对比其他5株菌丝体生物量存在较大差异，因此菌株CB0901、CB0902和CB0903发酵培养过程中对比其他菌株具有比较优势，按菌丝体生物量大小排序为CB0901> CB0903> CB0902。

图1 不同发酵时间各菌株菌丝体生物量Fig.1 Mycelial biomass of each strain at different fermentation times数值为平均值±SD(n=3)，同一图例中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下图同Values are the means ±SD(n=3),different lower case letters in the same legend indicate significant differences at P<0.05,the same below

2.2 不同发酵时间各菌株菌丝体胞内多糖含量比较

各菌株不同发酵时间菌丝体胞内多糖含量分析结果表明，在菌丝体发酵培养的不同时期胞内多糖的变化趋势不同，其中菌株CB0901、CB0902、CB0903、CB0906和L06随着发酵时间的延长胞内多糖含量呈不同程度地增加(图2)，菌株CB0904和CB0905胞内多糖含量随发酵时间延长先增加后减少，而菌株L0912胞内多糖含量随着发酵时间延长明显降低。培养至第7天时，菌株CB0903和CB0901的胞内多糖含量高于10%，分别达到14.36%和10.40%，显著高于其他菌株(6.43%～8.60%)。培养第14天时，菌株CB0903的胞内多糖含量达到21.96%，菌株CB0901次之，为17.61%。各菌株胞内多糖总量结果(表1)表明，各菌株在不同发酵时期胞内多糖含量存在明显差异，除菌株CB0905外，其他菌株均在第14天时多糖总量最高，其中以菌株CB0903为最优，多糖含量在第14天时达到0.302 4 g，综合菌丝体生物量及多糖产量，菌株CB0903具有较大优势。

图2 不同发酵时间各菌株菌丝体胞内多糖含量Fig.2 Intracellular polysaccharide content of mycelium of each strain at different fermentation times

2.3 不同发酵时间各菌株胞外多糖得率及多糖含量比较

对不同菌株不同发酵时间的发酵液进行胞外多糖的提取，并对其胞外多糖得率及多糖含量进行测定分析(表2)，结果表明不同菌株的胞外多糖得率存在较大差异，培养第7天时菌株CB0902、CB0903、L06胞外多糖得率显著高于其他菌株，分别达到2.55、2.75、2.30 g/L；培养至第14 天时，菌株CB0903和L06多糖得率分别增加到3.30和3.00 g/L，而菌株CB0902多糖得率与培养第7天相差不大(2.52 g/L)。不同菌株在不同发酵时间多糖得率的变化趋势也不相同，菌株CB0901、CB0903、CB0904和L06胞外多糖随发酵时间延长呈增加趋势；菌株CB0902、CB0905、CB0906、L0912多糖得率呈先增加再减少趋势，培养第10 天时，多糖得率最高，这可能与不同发酵培养过程中生长代谢特性不同有关。

菌株发酵胞外多糖含量测定结果表明，不同菌株在不同发酵时期胞外多糖含量均较高，达到69%以上。通过胞外多糖得率及多糖含量计算胞外多糖产量可知(表1)，菌株CB0901、CB0903、CB0904胞外多糖随着发酵时间延长多糖含量逐渐增加，发酵第14天时，多糖含量最高，其他菌株在发酵第10天时，多糖含量最高，比较各菌株胞外多糖总量可知，发酵第14天时，菌株CB0903多糖含量最高，达到0.283 9 g。计算胞内和胞外多糖总量，发酵第14天时各菌株总多糖均最高，菌株CB0903多糖总量同样最高，为0.586 3 g，其次为菌株CB0901，多糖总量为0.470 3 g，均显著高于其他菌株。综合菌丝体生物量、胞内多糖含量和胞外多糖含量，菌株CB0903在发酵产多糖性能上均具有比较优势，为产香菇多糖优势菌株。

表1 不同发酵时间各菌株多糖总量

表2 不同发酵时间各菌株胞外多糖得率及多糖含量

3 讨 论

香菇多糖是香菇最主要活性成分，在调节机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化等方面的作用显著，这些作用与香菇多糖的化学结构密切相关[5-7]。香菇品种不同，其发酵产多糖的性能不尽相同，乔艳明等[12]对秦巴地区主栽香菇品种采用6种培养基对菌丝生长状况和胞外多糖产量进行研究，其中66#菌株表现最优，胞外多糖产量为2.99 g/L；聂建军等[9]采用单因素及正交试验优化香菇A05发酵条件，胞外多糖产量为2.92 g/L；李昕竺等[13]收集国内87份香菇品种(菌株)以多糖含量及农艺性状为指标进行评价，筛选出新808、广香2044为优势杂交亲本，进而通过单孢杂交初步获得农艺性状优良、产量高、粗多糖含量高的两个优势菌株——212号、3号。本研究采用常规香菇液体发酵培养基[10]对采自长白山的6株野生香菇菌株发酵产胞内多糖和胞外多糖性能进行了评价，并以辽宁地区的栽培菌株L06和L0912作为对照菌株，筛选的菌株CB0903培养至第14天时，菌丝体生物量为13.77 g/L，胞内多糖含量为0.302 4 g，胞外多糖得率及其含量分别为3.30 g/L和0.283 9 g，总多糖量为0.586 3 g，与规模化栽培菌株L06和L0912相比，在产多糖性能方面具有较大优势，为野生香菇菌株资源化利用提供一定参考。