有益微生物缓解花生连作障碍机理研究进展

戴传超， 张 伟

(南京师范大学 生命科学学院，江苏 南京 210023)

花生是我国重要的油料作物，2019年种植面积达到460万hm2，年产量达到1 752万t[1]，占我国油料种植面积的35%。我国花生种植面积居世界第二位，产量居世界第一位，是少数具有比较优势的产业[2]。在大豆受到国外转基因品种冲击的情况下，花生对于保障我国油料安全显得尤为重要。我国花生产区分布广，全国大部分地区都能种植，其中华北平原地区和南方丘陵红壤地区是主要产区。由于很多地区花生需要连作种植，因此缓解连作障碍是需要解决的问题。花生连作障碍的产生，与病原菌富集、土壤微生物区系的恶化、土壤化感物质的积累、养分亏缺等有关[3-4]。缓解花生连作障碍也和上述因素的调控有关。微生物因素是导致花生连作障碍的重要因素，近年来，采用有益微生物缓解花生连作障碍取得了较好的效果。阐明有益微生物缓解花生连作障碍的机理，是该技术进一步发展和应用的关键。

1 有益微生物分解化感物质

化感作用指的是植物(包括微生物)向周围环境中释放化学物质(化感物质)，对另一种植物(包括微生物)生长和发育产生影响的作用[5-6]。许多植物根系可以产生化感物质，比如水稻、小麦、大豆和花生等。这些植物释放化感物质抑制周围其他植物的生长，有些情况下也会对自身的生长和发育产生不利影响，这也被称为化感自毒作用[7]。目前，已知化感物质主要包括：①酚类，如苯甲酸、对羟基苯甲酸；②香豆素类，如香豆素、补骨脂素；③醌类，如高粱醌、胡桃醌；④黄酮类，如木犀草素、六羟黄酮；⑤萜类，如麦角固醇、桉树脑；⑥生物碱，如小檗碱。植物释放化感物质的途径主要包括：①通过挥发性气体的方式释放；②通过根系分泌物的形式释放；③植物残茬降解产生的化感物质释放[7]。化感物质通过影响细胞膜通透性、光合活性、矿质元素吸收、DNA和蛋白质合成，从而抑制植物生长和发育[8-9]。

花生连作土壤中积累了大量的酚酸类化感物质，且随着连作种植年限的增加而增加。李培栋等[10]研究发现，连作10 a的花生土壤中，三种主要酚酸类物质，对羟基苯甲酸、香草酸和香豆酸的含量达到11.09 mg/kg干土，显著高于连作3和6 a的土壤，该浓度下的酚酸会显著降低花生幼苗的株高和根长。除了对花生植株造成直接的伤害外，酚酸类物质的积累还会刺激土传病原菌的生长和繁殖，加重花生的病害[11]。因此，降低连作土壤中化感物质，有助于花生的生长发育。研究发现花生相关微生物随植物凋落物进入土壤，并在土壤中作为腐生菌发挥植物残茬降解的功能。因此，花生相关微生物具有降解土壤化感物质的潜力。

目前，研究人员已经分离到多种能够降解酚酸类化感物质的微生物，主要包括：①细菌：芽胞杆菌(Bacillussp.)、假单胞菌(Pseudomonassp.)、根瘤菌(Rhizobiasp.)、伯克霍尔德菌(Burkholderiasp.)、红球菌(Rhodococcussp.)；②真菌：白腐真菌(Phanerochaetesp.)、拟茎点霉(Phomopsissp.)、镰刀菌(Fusariumsp.)[12]。例如，恶臭假单胞菌(PseudomonasputidaKT2240)具有降解没食子酸的能力，且gal基因簇在降解过程发挥着重要作用[13]。黄孢原毛平革菌可以有效降解常见酚酸：香草酸、阿魏酸和对羟基苯甲酸。该菌与三种酚酸共培养3 d，降解率分别达到98.39%、97.88%和58.20%[14]。南京师范大学微生物资源与生态课题组(本课题组)前期在探究连作障碍中酚酸类物质的微生物降解时发现，一株广谱植物内生真菌枫香拟茎点霉(Phomopsisliquidambaris)可以有效降解酚类和黄酮类化感物质，包括对羟基苯甲酸、阿魏酸、芥子酸、木犀草素、白藜芦醇[15-19]。同时，研究发现原儿茶酸是多种酚酸降解过程中普遍存在的中间代谢产物。原儿茶酸随后在原儿茶酸3,4-双加氧酶的催化下，进入三羧酸循环。此外，将枫香拟茎点霉施加至连作花生土壤中，可有效降低花期后土壤中对羟基苯甲酸、香草酸和香豆酸的含量[11]，并显著提高花生的产量。

酚酸类物质的降解主要涉及到酚酸脱羧酶、羟化酶和加氧酶。目前，对于酚酸类物质降解过程中的关键酶和关键基因调控的研究也取得重要进展。Yoshida等[20]鉴定出根瘤菌(Rhizobiumsp. strain MTP-10005)参与龙胆酸代谢相关的基因簇，包括graRDAFCBEK、graA、graB、graC和graD。酶学实验表明graD、graA、graC和graB分别编码一个间苯二酚羟化酶(EC 1.14.13.x)的还原酶(GraD)和氧化酶(GraA)组分，马来酰乙酸还原酶(GraC)(EC 1.3.1.32)和偏苯三酚1,2-双加氧酶(GraB)(EC 1.13.11.37)。Chen等[15]发现对羟基苯甲酸羟化酶、3,4-二羟基苯甲酸脱羧酶、邻苯二酚1,2-双加氧酶是枫香拟茎点霉降解对羟基苯甲酸所需的关键酶。Wang等[18]指出枫香拟茎点霉在降解木犀草素时，原儿茶酸3,4-双加氧酶和偏苯三酚1,2-双加氧酶是降解过程中的关键酶。

2 有益微生物改变花生根际微生物区系

土壤微生物区系的失衡是导致花生连作减产的重要原因之一。化感物质可以作为病原真菌的碳源[11]，因此，连作土壤微生物群落呈现出病原真菌丰度增加，有益真菌减少，以及病原细菌增加等特征。Li等[21]报导连作种植显著增加结荚期和成熟期时花生根际土壤中尖孢镰刀菌、淡色生赤核菌、茎点霉等病原真菌的丰度，降低木霉等有益真菌的丰度。相似地，花生连作根际土壤中的细菌(特别是有益细菌)多样性降低，细菌群落功能简化[22-23]。通常而言，土壤中细菌和放线菌种群多样性越高，其限制病原菌生长和繁殖的能力就越强。因此，连作花生土壤微生物区系的改善主要是降低土传病原真菌的丰度和/或增加有益微生物的丰度。目前，修正连作花生土壤微生物区系的措施主要包括轮作换茬、施加有机肥、土壤消毒和使用有益微生物制剂，比如菌根菌、根际促生细菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)。

田间试验表明使用微生物制剂可以有效地缓解农作物的连作障碍。封海胜等[24]报道生物菌剂的施加可以显著增加花生生长和荚果产量。Ma等[25]报道施加粘质沙雷氏菌RZ-21可以增加花生连作土壤细菌数量，降低真菌，特别是镰刀菌的数量，从而增加花生荚果数目。粘细菌(Corallococcussp. strain EGB)固体发酵菌剂通过调控土壤微生物区系，从而降低土壤尖孢镰刀菌的丰度[26]。丛枝菌根真菌(Arbuscualr mycorrhizal fungi, AMF)已经被广泛用作微生物制剂，可以有效地改善根际微环境，增加植物营养物质摄取和胁迫耐受能力。在土壤中施加AMF菌剂不仅可以增加有益微生物的数量，还可以降低土传病原菌的丰度。因此，AMF菌剂也被用来缓解花生连作障碍。例如，崔利等[27]研究报道摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)可以降低花生根际曲霉、镰刀菌和赤霉菌丰度，增加细菌Gaiella丰度，从而提高花生产量和品质。

综合已有研究的报道，我们认为有益微生物菌剂修正连作花生根际微生物群落的机制可能包括降解化感物质、改变花生根系分泌物组分、拮抗土传病原菌的繁殖和扩散等。植物根部释放化感物质，如酚酸类物质不仅对植物造成直接的损伤，还作为碳源促进病原菌在土壤里的存活和繁殖。例如，酚酸类物质刺激镰刀菌的生长和毒素的产生[28-29]。因此，改变花生根系分泌物的组成，减少根际土传病原菌的丰度，降低病害发生的几率，可一定程度上缓解花生连作障碍。Xie等[11]报道枫香拟茎点霉通过降解土壤中酚酸类物质对羟基肉桂酸、香草酸和对羟基苯甲酸，降低土壤中镰刀菌的丰度，缓解花生根腐病害。此外，枫香拟茎点霉定殖在花生根内，改变花生根系分泌物组分，增强花生根瘤菌的趋化和繁殖，增加根际细菌，包括根瘤菌的丰度[30-31]。有益细菌组成的生防菌剂通过产生抗生素、溶菌酶、铁载体等杀死土传病原菌，达到降低病害的效果。例如，粘细菌(Corallococcussp. strain EGB)通过分泌胞外酶β-1,6-葡聚糖酶GluM，降解真菌细胞壁，从而杀死真菌降低植物病害[32]。根际促生细菌通过产生铁载体，与病原菌竞争铁，从而降低病原菌数量[33]。因此，通过微生物菌剂改善连作土壤微生物群落和降低花生病害，是缓解花生连作障碍的一项经济有效的措施。但微生物菌剂的使用效果会受到田间温度、湿度和土著微生物的影响。因此，针对不同地区、气候、土壤环境和作物，开发相应的微生物菌剂是必要的。此外，连作花生微生物群落的解析和改善都集中于根际土壤环境，对于花生地上部分组织(叶和花)微生物的探究还不足。最近有研究报导叶际微生物的紊乱会引起叶片病害，降低植物的光合活性[34]。因此，未来的研究应关注连作花生叶际微生物群落的变化，以及开发针对叶部病害的微生物菌剂。

3 有益微生物促进花生抗病

连作种植导致土壤中病原菌积累，引起花生病害是导致连作花生产量下降的重要原因。其中由病原真菌，包括镰刀菌、炭疽病菌、齐整小核菌等引起的根腐病、叶斑病、茎腐病是主要的花生病害。病原菌的积累主要是因为土壤化感物质的积累，以及拮抗微生物的减少。目前，降低花生病害的措施主要有土壤熏蒸消毒、施加生防菌、合理的间作等。土壤杀菌剂的使用可以有效地控制土传病病原菌密度，降低花生病害。但是，土壤熏蒸剂的使用会带来环境污染和人体健康等新的问题。合理的间作是降低花生病害的有效措施。田间试验表明间作可以提高作物根际土壤细菌数量和多样性，同时改善土壤理化性质和土壤养分循环[35-36]。

利用微生物防治花生病害，就是将生防菌以一定的形式施加到连作土壤中，分解土壤有害物质、促进养分循环、改善土壤酶活和土壤微生物群落结构，降低土壤中病原真菌密度，诱导植物系统免疫，降低花生病害，增加花生产量。微生物防治连作花生病害主要的机制包括拮抗土壤病原菌、调节土壤微生物群落和诱导植物系统防御等。拮抗土壤病原菌和调节土壤微生物群落在上节中已阐述。因此，本节重点讨论微生物诱导植物系统(Induced Systemic Resistance，ISR)，抵抗花生病害。这个过程是由生防菌的效应子蛋白或挥发物触发，增强宿主植物的免疫力，从而降低病原菌的发病率和严重程度[37-38]。一些信号分子，比如茉莉酸(Jasmonic acid)、乙烯(Ethylene)和水杨酸(Salicylic acid)参与其中[37]。Madhaiyan等[39]报道接种一株甲基杆菌通过系统诱导花生防御相关的苯丙氨酸解氨酶、β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶，从而抵抗由黑曲霉和白绢病菌引起的叶斑病。相似地，Kishore等[40-41]报道预先喷施一株能降解几丁质的粘质沙雷氏菌(SerratiamarcescensGPS5)和一株不能降解几丁质的铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaGSE18)可以增强花生几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，并降低花生晚斑病和茎腐病。有益真菌在防治花生病害方面也有一定的研究。花生种子用木霉(TrichodermaharzianumITEM3636，TrichodermalongibrachiatumITEM3635)处理降低腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)引起的根腐病害[42]。植物内生真菌枫香拟茎点霉通过诱导抗氧化酶、胼胝质沉积、细胞木质化和植物抗毒素积累来抵抗叶斑病和根腐病[43]。进一步的研究表明枫香拟茎点霉预接种通过SA-依赖的防御信号途径来激活花生病程相关蛋白，达到抵抗病原菌的效果[44]。

4 有益微生物促进花生结瘤固氮

作为豆科植物，花生可以与土壤中的根瘤菌，主要是慢生根瘤菌建立共生关系，形成根瘤结构，固定空气中的氮气。花生-根瘤菌结瘤固氮为花生生产提供了大部分的氮素。花生和根瘤菌的结瘤固氮过程分为相互作用双方的识别、结瘤的起始、根瘤的发育和衰老[42，45]。在进入花生根组织之前，根瘤菌必须在根表面定殖。这个过程包括根瘤菌向根部的移动，两者相互识别，最后黏附在根上。根系分泌物中的糖、氨基酸和有机酸等被证明可以诱导慢生根瘤菌向花生根部的趋化运动[30-31]。其中，黄酮类物质包括芹菜素、木犀草素、染料木黄酮可以诱导慢生根瘤菌结瘤基因的表达，诱导结瘤因子(nodulation factors)的合成[30-31]。结瘤因子被宿主植物细胞膜上的特定受体识别，激活共生信号通路(Symbiosis signaling pathway)。与研究较为透彻的根瘤菌根毛侵染方式不同，慢生根瘤菌侵染花生的模式是较为古老的裂隙侵染[42，46]。根瘤菌穿过细胞壁，进入皮层细胞，随后根瘤菌快速繁殖和分化，形成根瘤。

连作种植土壤可以认为是多种生物和非生物胁迫的综合环境。已有研究报导花生连作种植降低根部根瘤数目和固氮能力[47]。因此，提高花生结瘤和固氮能力是增加连作花生产量的有效措施。目前，外源有益微生物促进连作花生结瘤和固氮的可能机制包括：①增加土壤根际中花生根瘤菌的丰度；②产生植物激素促进花生根系发育和根瘤发育；③促进花生对于营养元素的吸收；④产铁载体；⑤增加花生对于病原菌的抗性。Zhang 等[48]发现枫香拟茎点霉可以形成菌丝网络，协助慢生根瘤菌扩散至花生根际，促进花生起始结瘤。同时，该研究表明根瘤菌的趋化和运动被系统诱导，根瘤菌的主动运动与此诱导有关。此外，Xie等[30]和Wang等[31]发现枫香拟茎点霉作为内生菌定殖花生，可以增加根系分泌可溶性糖、氨基酸、有机酸、酚酸和黄酮等物质，这些分泌物可以导致慢生根瘤菌趋化性并促进其生长。因此，枫香拟茎点霉一方面降解土壤酚类化感物质，弱化其对于花生根瘤菌趋化的干扰，另一方面作为菌丝通道以及改变根系分泌物组分，增加根瘤菌在根际的富集。此外，枫香拟茎点霉被报道可以增加根瘤内部可培养有益细菌的数量，在促进结瘤和固氮中可能发挥着一定的作用[49]。已有研究报道有益微生物通过产生生长素促进植物根系发育，增强结瘤。接种产生长素的枫香拟茎点霉可以促进花生结瘤[50]。值得注意的是，Zhang等[50]证明生长素不仅可以通过增加花生侧根形成，为结瘤提供更多位点，而且还直接作用于结瘤过程，即促进根瘤维管束形成和增强根瘤的碳代谢。Li等[51]报道与轮作相比，连作花生根部生长素信号相关的基因显著下调。因此，产生长素微生物的存在可一定程度缓解连作对于根系发育和结瘤的抑制效应。尽管结瘤固氮为宿主提供大量的氮素，但是其过程需要宿主植物提供大量的营养物质，例如碳、磷和铁[52]。许多有益微生物具有溶磷和产铁载体的能力。磷和铁对于植物的光合作用和根瘤的形成和发育是必须的。比如，铁的不足使得结瘤起始延迟，以及根瘤的固氮活性下降[53-54]。溶磷和产铁微生物通过为植物提供磷和铁，一方面促进光合作用，为结瘤提供碳源，另一方面促进根瘤的形成和发育。由土传病原真菌引起的花生病害是限制连作花生产量的主要原因[21]。连作花生常见的病害包括由真菌引起的根腐病、茎腐病、叶斑病、锈斑病和炭疽病，以及由细菌引起的青枯病等。这些病害抑制植物的生长发育，降低根瘤的数目和固氮。同时，根际处的病原菌可以与根瘤菌竞争生存空间和营养物质，降低根瘤菌的数量。有益微生物通过直接地拮抗或是间接通过ISR，降低花生病害，促进结瘤和固氮。值得注意的是，大部分筛选出来的有益微生物同时具备产生长素、溶磷、产铁载体和拮抗病原菌活性的能力。此外，由于微生物和微生物之间的相互作用可以进一步提高其促植物生长活性，一些研究开始尝试构建合成微生物群落(Syncom)来协助植物抵抗外界胁迫[55-56]。目前还鲜见合成微生物群落在连作花生结瘤和增产方面的研究。因此，合成微生物的建构以及对于连作花生结瘤和固氮能力的评价会是未来研究的方向之一。

5 有益微生物促进花生养分吸收

土壤养分失衡是花生连作障碍发生的重要原因。由于花生对于养分的选择性吸收，导致土壤有效养分失衡，特别是微量元素的缺乏。有效养分的失衡一方面导致花生生长发育不足、抗病能力下降，造成花生果空壳，另一方面会引起微生物区系的改变[57]。微量元素是植物生长发育过程不可缺少的元素，它们参与植物体内几乎所有新陈代谢过程，缺乏时可严重影响作物产量和品质。花生荚果的形成需要从土壤中摄取大量的钙、硼和钼。连作土壤缺乏钙、硼和钼，导致大量花生果空壳[58]。土壤中铁的缺乏可导致花生结瘤不足[53]，以及植物防御能力下降[59]。有益微生物已经被证明可促进植物养分吸收，增加植物对于胁迫的耐受能力。尽管在连作土壤中施加足够的氮、磷、钾、铁、硼、钼等元素，花生总干物质和荚果产量仍随着连作年限的增加而降低[60]。因此，提高连作花生对于土壤养分的吸收尤为重要。

有益微生物，主要是有益真菌被报道能促进植物对于养分的吸收。真菌与宿主植物建立共生关系，形成大量根外菌丝，一方面扩大根的吸收范围，摄取土壤养分和水，提供给宿主植物；另一方面分泌含碳化合物活化菌丝周围细菌[61-62]。AMF与苜蓿建立共生后，根外菌丝释放果糖，提高解磷细菌磷酸酶活性，促进植物对于磷的吸收。Labidi等[63]发现在碳酸钙胁迫下，AMF共生能够促进植物根部吸收铁、锌和铜。有趣的是，Xie等[64]和苏春沦等[65]发现在连作种植条件下，内生真菌枫香拟茎点霉接种可促进花生对于大量元素氮、磷、钾和微量元素钼、铁和硼的吸收，改善花生的生理代谢水平，提高花生的产量和品质。进一步的研究发现枫香拟茎点霉提高了花生根中铁转运基因FRO1和IRT1，以及钼转运基因MOT1的表达[65]。考虑到钼铁元素在花生结瘤中的重要性，因此，枫香拟茎点霉介导的连作花生结瘤固氮增强可能部分归因于钼铁元素吸收的增加。有意思的是，在干旱胁迫下，枫香拟茎点霉接种重构了花生根际丛枝菌根真菌群落，增加了巨孢囊霉属，从而帮助花生抵抗干旱[66-67]。因此，我们认为枫香拟茎点霉促进连作花生对于养分吸收的部分原因可能是其重构了根际丛枝菌根群落。

6 展 望

花生连作障碍是生产中迫切需要解决的问题。由于不同地区土壤特性、气候原因，解决花生连作障碍需要采取针对性的措施。阐明形成连作障碍的原因，筛选微生物缓解连作障碍，并从理论上进行阐述，是缓解花生连作障碍的重要手段。由于单一微生物功能往往有限，而形成花生连作障碍的原因是多方面的，因此采用多种微生物协同作用，将是未来缓解花生连作障碍的重要措施。目前在这个领域还需要更多的有针对性的研究。