长链非编码RNA HOTAIR对胰腺癌细胞增殖、迁移能力的影响

成洪杰，张 晓，崔培林

1.首都医科大学大兴教学医院消化内科，北京 102600；2.北京市大兴区榆垡镇中心卫生院；3.首都医科大学附属北京天坛医院国际医疗部综合内科

胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，发病率和死亡率高。根据最新中国癌症城市报告[1]，2013年中国城市居民中，胰腺癌发病率为6.95/10万，死亡率为6.18/10万，且发病率和死亡率呈逐年升高的趋势。胰腺癌的早期诊断困难，就诊时，只有不足20%的患者适合接受手术治疗；晚期治疗困难，进展期胰腺癌患者的中位生存时间不足6个月[2]。鉴于胰腺癌恶性程度高、早期诊断难、晚期治疗难、易发生局部浸润和全身转移，深入探索胰腺癌发生发展的分子机制，发现潜在临床治疗靶点尤为重要[3]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的不具有蛋白质编码功能的RNA分子总称。研究[4-6]显示，lncRNA在多种肿瘤中存在异常表达，与肝癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等密切相关，lncRNA可通过调控基因表达，影响肿瘤的发生、发展、转移、预后等。近年来，有关lncRNA在胰腺癌发生、发展中的作用得到了越来越多的关注。研究[2-3]表明，多种lncRNA在胰腺癌组织中存在异常表达，lncRNA可能在胰腺癌的发生发展中起重要作用。HOTAIR、MALAT1、H19、gas5、HOTTIP、PVT-1等多种lncRNA与胰腺癌的发生、发展、转移和预后有明显相关性。

HOX的反义基因间RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是第一个被发现与胰腺癌有关的lncRNA分子，长度为2 158 bp，位于染色12q13.13的HoxC位点。近年来研究表明，HOTAIR在乳腺癌、肝癌、食管癌、结肠癌等存在异常表达[7-11]，HOTAIR高表达增加了肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移能力。研究[2-3]表明，HOTAIR可能是一种原癌基因，在胰腺癌发生发展中起着重要的作用。研究[12]发现，HOTAIR在胰腺癌组织中表达水平显著上调，与胰腺癌周围淋巴结转移及远处浸润密切相关，并且异常表达HOTAIR还是影响胰腺癌患者临床预后的重要因素之一，高表达水平的HOTAIR预示着较短的生存期。

目前，关于HOTAIR在胰腺癌中作用的报道仍然较少，研究尚处于初步阶段，HOTAIR在胰腺癌中的生物学功能尚不明确，具体发挥作用途径和分子机制更是知之甚少。因此，本研究体外培养胰腺癌细胞，旨在研究HOTAIR对胰腺癌细胞增殖、迁移等影响，为胰腺癌的临床靶点治疗提供可能的方向和实验依据，为胰腺癌的诊断和治疗开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人胰腺癌细胞系AsPC-1和Panc-1购自美国ATCC细胞中心；DMEM高糖培养基、质量浓度为100 g/L的胎牛血清、青链双抗购自美国Gibco公司；Trizol试剂、质粒表达载体pcDNA3.1、转染试剂Lipofectamine 2000均购自美国Invitrogen公司；小干扰RNA(siRNAs)和阴性对照siRNA(si-NC)由北京健坤禾润科技有限公司代购；CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所；Transwell小室购自美国Millipore公司；GoScriptTMReverse Transcription System A5001购自美国Promega公司；GoTaq®qPCR Master Mix A6001购自美国Promega公司；RQ1 Rnase-Free Dnase M610A购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：人胰腺癌细胞(Panc-1、AsPC-1)用DMEM高糖培养基培养，补充含质量浓度为100 g/L的胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml链霉素，置于37 ℃、体积分数为5% CO2的饱和湿度恒温培养箱中培养。每1～2 d更换1次培养基，当细胞融合度为80%～90%时进行传代培养。

1.2.2 获取目的基因和构建质粒：查阅基因文库，发现并找到人胰腺癌细胞目的基因HOTAIR转录mRNA核苷酸序列，利用qRT-PCR技术逆转录形成的cDNA再扩增形成一个全长的HOTAIR片段，用于扩增的HOTAIR的寡核苷酸序列为：上游：5′-CATGGATCCACATTCTGCCCTGATTTCCGGAACC-3′，下游：5′-ACTCT-CGAGCCACCACACACACACAACCTACAC-3′，分别包含外源性Hind Ⅲ和Xho Ⅰ位点。验证PCR的产物并亚克隆至哺乳动物表达载体pcDNA3.1中。

1.2.3 质粒转染细胞：取对数生长期胰腺癌细胞接种于细胞培养板，待细胞贴壁且融合度为40%～60%时，通过Lipofectamine 2000进行载体及对照组的转染，具体方法参见产品说明书。注意转染前更换为无血清培养液；转染后6 h更换含质量浓度为100 g/L的胎牛血清培养液。第一步转染pcDNA3.1-HOTAIR至人胰腺癌细胞(Panc-1、AsPC-1)中，以空白pcDNA载体(pcDNA3.1-NC)作阴性对照(阴性对照组)，空试剂做空白处理(试剂空白组)。第二步转染HOTAIR基因小干扰RNA(siRNA-HOTAIR)至人胰腺癌细胞(Panc-1、AsPC-1)中。应用3条独立的小干扰RNA(siRNA-HOTAIR-1187、siRNA-HOTAIR-83、siRNA-HOTAIR-1524)分别转染两株胰腺癌细胞，寻找并发现HOTAIR干扰敲低率最佳的siRNA。以阴性siRNA(si-NC)作对照，空试剂做空白处理。3个独立的HOTAIR siRNA靶序列分别为：siRNA-HOTAIR-1187：5′-GCACUGUCUCUCAAAUAAUTT-3′；siRNA-HOTAIR-83：5′-GCACAUUCUGCCCUGAUUUTT-3′；siRNA-HOTAIR-1524：5′-GCCUUUGCUUCGUGCUGAUTT-3′。

1.2.4 qRT-PCR检测HOTAIR表达量：收集转染后48 h的胰腺癌细胞，按Trizol试剂说明书提取HOTAIR总RNA。使用GoScriptTMReverse Transcription System和GoTaq®qPCR Master Mix进行qRT-PCR分析，检测HOTAIR表达水平，结果用磷酸甘油酸脱氢酶(GAPDH)的表达量进行标准化。HOTAIR的PCR上游引物：5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物：5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。分析qRT-PCR的结果并计算其相对于临界循环次数的值，然后转换为相对GAPDH的倍数改变，采用2-ΔΔCt法进行标准化。

1.2.5 CCK8法检测细胞增殖活力：取对数生长期的胰腺癌细胞以起始1.0×103个/孔接种于96孔板，每孔加培养液100 μl，24 h后转染，每株胰腺癌细胞均设立实验组和阴性对照组(NC)，每组设置5个复孔。向每孔加入10 μl CCK溶液，注意不要在孔中生成气泡，否则会影响吸光度值(OD)的读数。分别于转染后0 d、1 d、2 d、3 d和4 d检测细胞增殖。

1.2.6 Transwell细胞迁移实验：胰腺癌细胞转染后48 h进行Transwell细胞迁移实验。将胰腺癌细胞消化后铺在transwell小室上层，起始数量为2.0×104个/100 μl。含质量浓度为100 g/L的胎牛血清的培养基600 μl位于下层。24 h取出小室，用棉签擦去小室内壁一面细胞，外侧细胞结晶紫染色。显微镜下拍照。之后2% SDS裂解细胞(600 μl)。之后移入96孔板检测OD值。

2 结果

2.1 HOTAIR在人胰腺癌细胞系AsPC-1和Panc-1的表达情况

2.1.1 AsPC-1细胞：HOTAIR转染成功过表达，差异有统计学意义(P<0.05)。AsPC-1的敲低取得成功，siRNA-1187检测到最高敲低率，约为89.6%。其余两条分别为 43.8%(siRNA-83)，74.3%(siRNA-1524)，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1、图1)。PCR扩增曲线和熔解曲线良好，扩增产物特异性良好(以AsPc-1过表达为例，见图2)。

2.1.2 Panc-1细胞：HOTAIR转染成功过表达，差异有统计学意义(P<0.05)。Panc-1的敲低取得成功，siRNA-83敲低率最高，相对阴性白质粒对照组平均值，敲低效率约为62.2%，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2、图3)。PCR扩增曲线和熔解曲线良好，扩增产物特异性良好。

表1 AsPC-1细胞中HOTAIR相对表达量Tab 1 The relative expression of HOTAIR in AsPC-1

图1 AsPC-1细胞HOTAIR过表达(A)和敲低(B)Fig 1 The overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR in AsPC-1

图2 AsPC-1过表达扩增曲线(A)和AsPC-1过表达熔解曲线(B)Fig 2 Amplification curve: the overexpression of HOTAIR in AsPC-1 (A) and melting curve: the overexpression of HOTAIR in AsPC-1 (B)

表2 Panc-1细胞中HOTAIR相对表达量Tab 2 The relative expression of HOTAIR in Panc-1

2.2 HOTAIR对人胰腺癌细胞AsPC-1和Panc-1增殖的影响

2.2.1 AsPC-1细胞：HOTAIR过表达组与空载体对照组相比，细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05)(见图4A)，这可能与HOTAIR本身在AsPC-1细胞中的高表达相关。但HOTAIR敲低实验中，3组HOTAIR敲低表达的细胞增殖能力普遍弱于阴性对照组，0～2 d此趋势较明显，差异有统计学意义(P>0.05)(见图4B)。

2.2.2 Panc-1细胞：跟踪细胞生长状况表明，相比阴性对照组，0～3 d过表达HOTAIR组呈生长优势；相比阴性对照组，HOTAIR敲低效率较高的siRNA-83和siRNA-1187组增殖能力减弱(见图5)。

图3 Panc-1细胞HOTAIR过表达(A)和敲低(B)Fig 3 The overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR in Panc-1

图4 AsPC-1细胞HOTAIR过表达(A)和敲低(B)对细胞增殖的影响Fig 4 The effect of overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR on proliferation in AsPC-1

图5 Panc-1细胞HOTAIR过表达(A)和敲低(B)对细胞增殖的影响Fig 5 The effect of overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR on proliferation in Panc-1

2.3 HOTAIR对人胰腺癌细胞AsPC-1和Panc-1迁移的影响

2.3.1 AsPC-1细胞：Transwell结果表明，相比阴性对照组，过表达HOTAIR组细胞迁移能力增强。siRNA-1187转染的细胞迁移能力明显下降，而siRNA-83和siRNA-1524变化相对阴性对照组不明显(见图6)。

2.3.2 Panc-1细胞：Transwell结果表明，相比阴性对照组，过表达HOTAIR组细胞迁移能力增强。敲低效率较高的siRNA-83和siRNA-1187转染的细胞迁移能力明显下降，而siRNA-1524变化相对阴性对照组不明显(见图7)。

注：A1为HOTAIR过表达组，A2为A1的阴性对照组，B1为siRNA-1187组，B2为B1的阴性对照组，图片均放大100倍。

注：A1为HOTAIR过表达组，A2为A1的阴性对照组,B1为siRNA-83组，B2为B1的阴性对照组，图片均放大100倍。

3 讨论

胰腺癌是常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，转移出现早，早期诊断困难，晚期治疗困难，预后较差。目前胰腺癌的治疗仍以手术切除联合术后化疗为主，虽然患者术后中位生存期延长，但生存质量并未得到显著提高。因此，深入研究胰腺癌发生发展机制和靶向治疗尤为重要。

lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的不具有蛋白质编码功能的RNA分子总称。近年来研究[7-11]表明，lncRNA与肝癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展相关，HOTAIR高表达可能增加了肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力。此外，HOTAIR高表达常常提示肿瘤患者不良的预后。

近年来，有关lncRNA在胰腺癌发生、发展中的作用得到了越来越多的关注，为临床上胰腺癌的早期诊断、治疗和预后提供了新的方向。Kim等[12]研究发现，HOTAIR在胰腺癌组织中表达水平显著上调，与胰腺癌周围淋巴结转移及远处浸润密切相关，并且高表达水平的HOTAIR常预示着较短的生存期。但关于HOTAIR在胰腺癌中作用的报道仍然较少，研究尚处于起步阶段。

HOTAIR由Rinn等[13]于2007年首次发现并描述，是第一个被发现以反式转录干预基因表达的lncRNA。HOTAIR仅存在于哺乳动物中，由2 185个核苷酸组成，位于染色体12q13.13的HOXC11与HOXC12之间，包括6个外显子[14]。

HOTAIR有分子骨架的作用，具有特异性双向结合能力，能同时结合两种不同的组蛋白修饰复合体，并可能起到协调两者功能的作用。其5′端与多梳抑制复合体2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的核心组成部分之一EZH2结合，可使组蛋白H3第27位的赖氨酸三甲基化(H3K27me3)，介导PRC2至特定位点来沉默HOXD基因座及相关抑癌基因如HOXD10、JAM2、PCDH的转录从而促进肿瘤的转移复发；而3′端与赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶复合体(LSD1/CoREST/REST)结合，可使组蛋白H3第4位的赖氨酸去甲基化(H3K4deme)[15]，调控靶基因转录活性，在染色体层面调控目的基因活性[16]。进一步研究发现，HOTAIR可以通过PRC2依赖性和PRC2非依赖性两种途径来介导下游基因表达调控，但HOTAIR发挥调控作用的机制仍不完全清楚。

本研究体外培养胰腺癌细胞，通过调控HOTAIR在胰腺癌细胞中的表达水平，对其增殖、迁移能力进行分析。本研究发现，在HOTAIR过量表达实验中，HOTAIR过量表达可增强Panc-1细胞增殖能力，但对AsPC-1细胞增殖无影响，我们分析可能与HOTAIR在AsPC-1细胞本身呈高表达状态相关，进一步上调HOTAIR在AsPC-1的表达水平，其促进胰腺癌细胞增殖的作用和效果可能不显著；同时，过表达的HOTAIR可以同时增强AsPC-1细胞、Panc-1细胞的迁移能力。在HOTAIR敲低实验中，通过下调HOTAIR在胰腺癌细胞的表达水平，可以显著抑制AsPC-1细胞、Panc-1细胞的增殖和迁移能力，这与前人研究结果相吻合，提示HOTAIR可能促进了胰腺癌的发展，HOTAIR高表达可能与预后不良相关[12]。

综上所述，本研究表明，HOTAIR高表达可以增强胰腺癌细胞的增殖和迁移能力，下调HOTAIR表达会抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移能力，但由于人胰腺癌细胞种类较多，本研究只对AsPC-1和Panc-1两株胰腺癌细胞进行了研究，将来的研究可能涉及更多不同种类的胰腺癌细胞系，研究结果可能与本研究有所差异。此外，本研究仅是体外实验，研究结果尚需要进一步体内实验和临床试验的证实。