基于网络药理学研究桃红四物汤干预腰椎间盘突出症的机制

乔明珠，吕 浩，江 渟

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院骨伤一科，安徽 合肥 230031)

腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation，LDH)是一种常见的骨关节病，也是诱发腰痛的主要原因之一。其基本病理变化为腰椎间盘退行性变，纤维环部分或全部破裂，随即髄核(nules pulposus,NP)突出或脱出[1-2]。LDH可归属于中医学“腰腿痛”或“痹病”范畴。临床常用活血化瘀类药物治疗[3-4]。桃红四物汤首见于《医宗金鉴·妇科心法要诀》，由桃仁、红花、当归、熟地黄、白芍和川芎组成，组方严谨。近代医家在继承传统的基础上将其广泛应用于内科、皮肤科和骨伤科等疾病[5-7]。本研究采用生物信息学分析方法对桃红四物汤干预LDH的主要活性成分、作用靶点及信号通路进行筛选，揭示其作用机制，为桃红四物汤治疗LDH提供依据。

1 资料与方法

1.1 桃红四物汤有效化学成分及作用靶点的检索 通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)寻找桃仁、红花、熟地黄、当归、白芍、川芎6味中药的有效化学成分，对口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且类药性(drug-likeness,DL)≥0.18的活性成分进行初步筛选，获得活性化合物及其作用的蛋白质靶点，并根据已发表的文献报道补充与活性化合物相关的已知靶点。筛选完成后，在Uniprot蛋白质数据库中对化合物的作用靶点进行规范化。

1.2 LDH疾病相关靶点筛选 以“Lumbar disc herniation”为关键词依次查询GeneCards(https://www. genecards.org)、人类孟德尔遗传在线(online mendelian inheritance in man,OMIM)、疗效靶点数据库(therapeutic target database,TTD)、DRUGBANK(https://www.drugbank.ca)数据库，寻找治疗LDH的潜在靶点，整合4个疾病数据库中靶点，得到治疗LDH的靶点。

1.3 桃红四物汤与LDH共有靶点的确定 将桃红四物汤的药物靶点和LDH的靶点进行分析，汇总后取交集，确定药物与疾病的共同靶点。借助Venny 2.1在线绘图软件制作共同靶点文氏图。

1.4 桃红四物汤与LDH可视化网络的建立 使用STRING数据库在线平台(http://string-db.org)分析LDH与桃红四物汤共有靶点，获得蛋白互作网络图，以tsv格式导出。将文件代入到R软件编写程序中，以靶点蛋白之间的作用次数为参考，定义互作关系多的蛋白为核心蛋白，并制作条形图。将蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)的网络检索结果导入Cytoscape 3.8.2软件，调整节点(node)和边(edge)，形成可视化网络。

1.5 桃红四物汤干预LDH的基因通路富集分析 将共有靶点代入R软件编写的基因通路富集分析程序，对桃红四物汤干预LDH的蛋白质靶点进行通路富集和生物过程注释，获得显著富集的信号通路(P<0.05)，运用Cytoscape 3.8.2软件获得富集靶点的信息以及相关通路。根据分析结果，获取前20条通路，选择与研究的问题最相关的通路，结合基因表达水平变化的程度，对相关基因进行分析。

2 结果

2.1 桃红四物汤的化学成分筛选结果 根据OB≥30%且DL≥0.18，对检索到的活性成分进行筛选，共得到已验证的桃红四物汤活性成分69个，其中桃仁、红花、熟地黄、当归、白芍、川芎的活性成分数量分别为23、22、2、2、13、7个。根据OB值列出排在前10位的药物活性成分，见表1。

表1 桃红四物汤中OB值排在前10位的有效化学成分

2.2 桃红四物汤干预LDH的靶点预测结果 共获取药物靶点446个，其中桃仁、红花、熟地黄、当归、白芍、川芎的作用靶点数量分别为47、205、30、50、86、28个，汇总并去掉重复的靶点后共获得235个靶点。检索4个疾病数据库后共获得LDH的相关靶点1 990个，汇总并去掉重复的靶点后共获得1 243个靶点。将235个药物成分靶点与1 243个LDH靶点输入Draw Venny Diagram在线软件，绘制韦恩图，取交集后获得二者共有靶点82个。

2.3 桃红四物汤干预LDH的活性成分-靶点模型构建 借助Cytoscape 3.8.2软件构建桃红四物汤干预LDH的可视化“活性成分-靶点模型”。见图1。

注：TR、HH、SD、DG、BS、CX分别代表桃仁、红花、熟地黄、当归、白芍、川芎，圆形结点代表不同药物的活性成分，中间矩形代表LDH的靶点

2.4 PPI网络构建以及核心蛋白确定 将桃红四物汤与LDH共有的82个交集靶点上传至STRING数据库平台，进一步分析后得到PPI网络图，见图2。

注：图中线条代表蛋白质与蛋白质相互作用关系，连接靶点的线条数量与该靶点作为潜在靶点的可能性呈正相关

根据PPI网络中的连接结果，借助条形图进行可视化，可以得出肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、激活蛋白1(activator protein 1,JUN)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase 1, AKT1)与其他基因联系最密切，为PPI网络中的核心基因。见图3。

图3 桃红四物汤干预LDH的关键靶点条形图

2.5 采用基因本体论(gene ontology,GO)对桃红四物汤干预LDH的靶点进行功能富集分析 运用R3.6.1软件分析排在前10位的生物学过程(biological process,BP)、细胞组成(cellular component,CC)及分子功能(molecular function,MF)。生物学过程涉及对DNA结合转录因子活性的调节、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应等；细胞组成涉及转录调节复合体、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物、囊泡腔及分泌颗粒腔等；分子功能涉及DNA转录因子结合、受体活性、细胞因子活性等。见图4。

注：富集基因的数量由气泡节点的大小表示，其红色的程度代表显著状况

2.6 采用京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)对桃红四物汤干预LDH的靶点进行通路富集分析 运用R3.6.1软件和Cytoscape 3.8.2软件进行KEGG通路富集分析和治疗靶点-信号通路网络图的构建，得出桃红四物汤作用于LDH的靶点主要富集于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、晚期糖基化终末产物(advanced glycation end product，AGE)-AGE受体(receptor for AGE，RAGE)通路、TNF通路等。见图5。

图5 桃红四物汤干预LDH的靶点的KEGG通路富集分析

3 讨论

中药复方具有药味多、成分复杂、作用靶点多等特点，采用传统方法探究中药复方的作用机制尚有一定难度。生物信息学方法为从分子水平探讨中药复方的作用机制提供了机遇。腰痛是导致残疾的主要原因，约70%的人一生中会经历腰痛[8]。椎间盘退行性变是导致LDH发病的基本原因，其诱发机制尚不清楚，但细胞外基质(extracellular matrix，ECM)降解、炎症和细胞凋亡是导致LDH的常见原因[2]。当椎间盘开始退变时，细胞功能逐渐失衡，NP细胞含水量下降，NP细胞和纤维环内的胶原蛋白含量降低，ECM降解。基质金属蛋白酶(matria metalloproteinases,MMP)含量增加，炎症递质释放，致使椎间盘生物力学性能降低，纤维环变弱，甚至破裂。近年来针对LDH的手术更多地由开放式向微创转变，但手术可导致硬膜、神经根、大血管损伤，全身麻醉可导致不良反应，且术后恢复时间长、手术成本高，因此患者较难接受手术治疗。保守治疗仍是大多数LDH患者的首选治疗方法[9]。中医学认为，LDH的病机分为虚实两端：肾虚可致腰府失养，从而引起腰痛不能转侧；风寒湿邪外袭，经脉困阻，气血运行不畅，不通则痛。临床研究[10]表明，桃红四物汤配合椎间盘镜微创手术治疗LDH后，患者的腰椎活动度、直腿抬高角度、神经功能改善情况明显优于单纯手术治疗。桃红四物汤加减配合射频消融髓核成形术可促使患者血常规指标恢复，疼痛明显缓解[11]。桃红四物汤能够显著降低LDH患者炎症因子水平，改善临床症状体征[12-13]。可见，桃红四物汤具有活血化瘀、消肿散结、疏通经络的作用，治疗LDH的临床疗效确切。

借助Cytoscape构建药物的活性成分与疾病的靶点网络，结果显示桃红四物汤干预LDH具有多靶向的特点。在PPI网络中构建药物-靶点蛋白模型，对药物靶点和疾病靶点之间的关系进行可视化分析，得出TNF、JUN、EGF、EGFR、AKT1等为桃红四物汤干预LDH的核心靶点。TNF作为人体免疫反应的关键递质，可以调控免疫系统、细胞存活的信号通路，以及调节增殖代谢过程[14]。研究[15-16]表明，桃红四物汤对炎症因子、免疫活性因子具有调节作用。JUN作为AP-1转录因子家族的成员，对细胞外的各种刺激具有功能作用，JUN可促进NP细胞增殖，减少NP细胞凋亡，增加NP细胞的ECM合成，下调炎症因子水平[17]。通过激活AKT通路可以抑制NP细胞凋亡[18-19]。

GO生物富集分析结果显示，桃红四物汤干预LDH主要通过DNA结合转录因子活性、氧化应激反应以及对营养水平的反应。椎间盘开始退变时，细胞性能逐渐不稳定、纤维环胶原蛋白在结构和性质上发生改变，促使NP细胞内水分含量减少、蛋白多糖比例下降以及炎症递质大量释放。炎症细胞因子是炎症反应的产物，也意味着炎症级联反应被激活。随着退行性变进一步加深，NP细胞释放的促炎细胞因子也越来越多，如TNF-α、白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6[20]，这些细胞因子能够促进ECM降解[21-23]。

KEGG信号通路分析结果显示，与LDH密切相关的通路包括MAPK信号通路、TNF信号通路和AGE-RAGE通路等。TNF信号通路可以调节免疫反应、炎症反应、细胞凋亡和肿瘤发生等众多生物学活动[24]。近年来，有大量证据表明，TNF-α可刺激多种MMP和具有血小板反应素基序的溶栓素和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS)的表达，主要通过核转录因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)/MAPK信号通路诱导这些酶的表达[25]。MAPK通路主要参与细胞生长、发育、增殖以及分化等多个生理、病理过程[26]。Huang等[20]通过检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的表达，明确IL-33/ST2信号通路对LDH的镇痛作用和对炎症递质的调节作用是通过MAPK和NF-κB通路激活的。LDH患者的黄韧带细胞经受氧化应激反应后，可快速激活AKT、JNK和p38 MAPK通路，触发信号级联后，增强了炎症和纤维化标志物的表达[27]。AGE通过与RAGE结合，产生炎症前细胞因子、活性氧诱导炎症和免疫抑制，活化半胱天冬蛋白酶3和MMP等的表达[28]。桃红四物汤含药血清可下调β3整合素、MMP和P38，激活FAK/MAPK信号表达[29]。王伟军等[30]通过数据分析与实验验证桃红四物汤可以通过参与炎症相关的NF-κB通路和凋亡通路调控关键蛋白的表达，发挥抗炎、抗氧化应激作用。此外，LDH的发病及其相关信号通路主要涉及应激条件下细胞的免疫调节、炎症反应和细胞凋亡过程[31]。以上相关研究结果与本次分析结果基本相同，提示桃红四物汤对LDH具有确切疗效。

本研究表明，桃红四物汤中活性化合物可调节多种信号通路和作用于不同靶点，从而发挥治疗LDH的作用。由于本研究采用生物信息学分析方法，结果建立在模型预测基础上，因此所筛选的关键靶点、信号通路还需进行实验验证。