益气活血通络方通过抑制P2X7介导的脊髓小胶质细胞活化改善糖尿病大鼠神经病理性疼痛

周家梅，胡光民，程连芝，马俊龙，王帆竞，周 鹏，江爱娟

(1.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，安徽 合肥 230012)

神经病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病患者常见的慢性并发症之一，以外周体感异常直接引起的痛觉过敏、自发痛和诱发痛为主要症状[1]。以往研究认为，神经病理性疼痛是由神经细胞和神经系统功能的变化引起的。然而，临床上常用的以神经细胞为靶点的镇痛药物疗效并不理想，这表明某些非神经细胞因素在神经病理性疼痛的发生过程中发挥着重要作用[2-3]。因此，需要将研究的重点转移到神经细胞以外的其他细胞的潜在作用上。小胶质细胞是中枢神经系统中重要的免疫细胞，可以监测和稳定周围环境，有利于神经细胞的营养及修复[4]，在中枢神经系统的生理病理过程中发挥重要作用。

益气活血通络方是安徽中医药大学第一附属医院的院内制剂，其功效是益气养阴、活血通络，对糖尿病周围神经病变患者的四肢麻木、感觉迟钝和疼痛有较好疗效[5-6]，但其作用机制尚未明了。本研究拟通过高脂喂养4周联合腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(35 mg/kg)制备DNP大鼠模型[7]，观察益气活血通络方干预后，大鼠的机械痛阈和热缩足反应时间、大鼠脊髓组织中补体受体-3的单克隆抗体(monoclonal antibody of complement receptor type 3，OX42)和P2X7(purinergic 2X7)的表达情况，探讨益气活血通络方防治DNP的作用及其分子机制，为其临床应用提供更充分的科学依据。

1 材料

1.1 动物 80只SD大鼠，健康清洁级，雄性，6周龄，体质量180～210 g，购自南京青龙山动物实验中心[生产许可证号：SCXK(浙)2014-0001]。所有大鼠自由饮水，室内湿度25%～30%，室内温度20～25 ℃。

1.2 药物及试剂 益气活血通络方是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，由黄芪、当归、鸡血藤、生地黄、葛根、延胡索、威灵仙7味中药材组成，批号 20190228；甲钴胺片(1712070f)：卫材中国药业公司；STZ(批号 ez3414B220)：BioFroxx；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、趋化因子配体3(CC-chemokine ligand 3，CCL3)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶联免疫试剂盒(批号分别为202101、202101、202101)：江苏酶免实业公司；BCA蛋白定量试剂盒(批号 PICP123223)：ThermoFisher；ECL显影试剂(批号 ATSAP2501)：Abbkine；OX42(批号 ab1211)、P2X7(批号 ab109054)：Abcam。

1.3 仪器 血糖仪(5D-2型)：北京怡成；纤维丝测痛仪(Von Frey)：North Coast；智能热板仪(RB200型)：成都泰盟；凝胶成像分析系统(FCM)：protein simple；水浴锅(H11210)：Leica；电泳仪(mini protean 3 cell)：BIO-RAD；荧光显微镜(ECLIPSE Ni)：NIKON；冰冻切片机(CM1850)：徕克公司；酶联免疫分析系统(ATOM)：Maroche。

2 方法

2.1 DNP大鼠模型的制备、分组及给药 80只SD大鼠适应性喂养1周后，随机选择12只大鼠作为空白组，以普通饲料喂养，其余大鼠饲喂高脂饲料4周，单次腹腔注射STZ溶液35 mg/kg，72 h后测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，FBG>11.1 mmol/L认定为2型糖尿病大鼠。2周后，检测2型糖尿病大鼠机械痛阈和热缩足反应时间。如果两者都降低到基本值的85%以下，则确定为DNP模型复制成功大鼠。将DNP大鼠随机分为5组：模型组，益气活血通络方高剂量(9 g/kg，相当于成人临床用量的18倍)、中剂量(4.5 g/kg)、低剂量(2.25 g/kg)组和阳性对照组，每组12只。益气活血通络方高、中、低剂量组分别给予不同剂量益气活血通络方灌胃，阳性对照组大鼠予以甲钴胺(0.175 mg/kg)灌胃，模型组大鼠用等量的生理盐水灌胃。DNP大鼠模型复制成功时(即给药前)计为0周，治疗组大鼠连续灌胃给药8周。于治疗第0周每组随机取6只大鼠，禁食不禁水12 h，尾部无菌操作后取静脉血，血糖仪检测FBG值后，3只大鼠的L4—L6节段脊髓组织用于Western blot检测大鼠脊髓中OX42和P2X7蛋白表达水平，3只大鼠的L4—L6节段脊髓组织用于免疫荧光检测大鼠脊髓中OX42和P2X7蛋白表达水平。每组剩下的6只大鼠于第0、2、4、6、8周测机械痛阈值和热缩足反应时间。于治疗第8周每组取剩下的6只大鼠，禁食不禁水12 h，尾部无菌操作后取静脉血，血糖仪检测FBG值后，3只用于Western blot检测，3只用于免疫荧光检测。

2.2 大鼠FBG值测定 大鼠于治疗第0周和第8周，禁食不禁水12 h，尾部无菌操作后取静脉血，血糖仪检测FBG值。

2.3 大鼠机械痛阈测定 于第0、2、4、6、8周，将空白组、模型组和各给药组大鼠置于筛状金属板上，用有机玻璃罩分隔，待大鼠适应后，用纤维丝垂直刺激大鼠右后掌，大鼠出现阳性反应(抬腿躲避或者舔足)。每次间隔15 s，测5次，记录每次发生阳性反应的最小克数，取其平均值即为该大鼠的机械痛阈值。

2.4 大鼠热缩足反应时间测定 于第0、2、4、6、8周，将空白组、模型组和各给药组大鼠放入预热为52 ℃的智能热板仪中，在放入时同步进行计时，大鼠舔后足时结束计时，间隔15 min检测1次，测3次取其平均值为大鼠的热缩足反应时间。

2.5 ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平 给药第8周末，每组取3只大鼠腹主动脉血，离心，取上清，采用ELISA法，使用试剂盒测定血清TNF-α、IL-1β、CCL3含量。严格按照说明书的要求进行操作。

2.6 Western blot法检测大鼠脊髓中OX42、P2X7蛋白表达水平 给药第8周末，取大鼠的L4—L6脊髓组织，提取总蛋白，蛋白定量检测(BCA法)后，经SDS-PAGE垂直凝胶电泳，湿转法将蛋白转到NC膜上，5%脱脂奶粉常温封闭NC膜2 h，结束后分别加入OX42、P2X7和β-actin内参的特异性一抗，4 ℃孵育过夜，次日加入对应二抗常温孵育2 h后，按ECL显影试剂说明，在凝胶成像系统中自动显影。

2.7 免疫荧光检测大鼠脊髓中OX42、P2X7的表达水平 给药第8周末，各组大鼠于麻醉、4%多聚甲醛心脏灌注后，取L4—L6节段脊髓组织，获得冰冻切片。切片经血清封闭30 min后，滴加OX42或P2X7于4 ℃冰箱中孵育过夜，次日避光滴加荧光二抗，于37 ℃孵育1 h，封片后荧光显微镜下观察各组大鼠脊髓小胶质细胞中OX42和P2X7的显色情况，使用Image J计算OX42和P2X7各自的荧光强度。

3 结果

3.1 益气活血通络方对DNP大鼠FBG的影响 给药前(第0周)，与空白组比较，模型组和各治疗组大鼠FBG显著上升(P<0.05)，但模型组和各治疗组大鼠FBG差异无统计学意义(P>0.05)。干预8周后，与空白组比较，模型组和各治疗组大鼠FBG显著上升(P<0.05)；与模型组比较，益气活血通络方各剂量组和阳性对照组大鼠FBG水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：A.空白组；B.模型组；C.益气活血通络方高剂量组；D.益气活血通络方中剂量组；E.益气活血通络方低剂量组；F.阳性对照组；与空白组比较，*P<0.05

3.2 益气活血通络方对DNP大鼠机械痛阈的影响 给药前(第0周)，与空白组比较，模型组和各治疗组大鼠机械痛阈均显著下降(P<0.05)，模型组和各治疗组大鼠机械痛阈差异无统计学意义(P>0.05)。第2、4、6、8周后，与空白组比较，模型组机械痛阈显著下降(P<0.05)；与模型组比较，益气活血通络方各剂量组和阳性对照组机械痛阈均显著上升(P<0.05)。见图2。

注：A.空白组；B.模型组；C.益气活血通络方高剂量组；D.益气活血通络方中剂量组；E.益气活血通络方低剂量组；F.阳性对照组；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.3 益气活血通络方对DNP大鼠热缩足反应时间的影响 给药前(第0周)，与空白组比较，模型组和各治疗组大鼠的热缩足反应时间均显著缩短(P<0.05)，但模型组和各治疗组大鼠热缩足反应时间差异无统计学意义(P>0.05)。第2、4、6、8周后，与空白组比较，模型组大鼠热缩足反应时间显著缩短(P<0.05)；与模型组比较，益气活血通络方各剂量组和阳性对照组热缩足反应时间均显著延长(P<0.05)。见图3。

注：A.空白组；B.模型组；C.益气活血通络方高剂量组；D.益气活血通络方中剂量组；E.益气活血通络方低剂量组；F.阳性对照组；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.4 益气活血通络方对DNP大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平的影响 治疗8周后，与空白组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平显著上升(P<0.05)；与模型组比较，益气活血通络方高、中剂量组和阳性对照组大鼠血清TNF-α水平均显著下降(P<0.05)，低剂量组大鼠血清TNF-α水平有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)；益气活血通络方各剂量组和阳性对照组大鼠血清IL-1β、CCL3水平均显著下降(P<0.05)。见图4。

图4 益气活血通络方对DNP大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平的影响

3.5 益气活血通络方对DNP大鼠脊髓组织OX42和P2X7表达水平的影响 Western blot结果显示，第8周末，与空白组比较，模型组大鼠脊髓组织中OX42、P2X7蛋白表达水平均显著上升(P<0.05)；与模型组比较，益气活血通络方中剂量组和阳性对照组大鼠脊髓组织中OX42蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)，益气活血通络方各剂量组和阳性对照组大鼠脊髓组织中P2X7蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。见图5。

图5 益气活血通络方对DNP大鼠脊髓组织OX42、P2X7蛋白表达水平的影响

免疫荧光结果显示，与空白组比较，模型组大鼠脊髓组织中OX42(绿色)和P2X7(红色)荧光强度显著增强(P<0.05)；与模型组比较，益气活血通络方各剂量组和阳性对照组大鼠脊髓组织中OX42、P2X7荧光强度显著下降(P<0.05)。见图6、图7。

注：A.空白组；B.模型组；C.益气活血通络方高剂量组；D.益气活血通络方中剂量组；E.益气活血通络方低剂量组；F.阳性对照组

注：A.空白组；B.模型组；C.益气活血通络方高剂量组；D.益气活血通络方中剂量组；E.益气活血通络方低剂量组；F.阳性对照组；与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

有研究[8]报道，2019年全球有4.63亿糖尿病患者(20～79岁)，中国糖尿病患者总数为1.16亿，居首位。而20%～30%糖尿病患者最终伴发DNP，DNP会导致不同程度的身体残疾，且长期的慢性疼痛会导致失眠、抑郁、焦虑等症状[1]，严重降低患者的生活质量，这是疼痛研究领域的一个热点和难点课题。

目前，DNP的发病机制尚未完全阐明，临床暂无特效药物，一般只能在控制血糖的同时给予止痛、营养神经和改善微循环等对症支持治疗，这能起到一定的治疗和缓解作用，但在改善患者全身症状方面疗效不理想。常用的药物为抗癫痫药(普瑞巴林、加巴喷丁等)和抗抑郁药(度洛西汀、阿米替林等)，虽然能有效缓解症状，但带来的不良反应常常是患者所无法承受的[9]。中药的多靶点性与DNP本身的复杂性决定了中药复方在治疗此病的独特优势。

OX42作为小胶质细胞活化的表面标志物，是小胶质细胞常用且具有高度特异的表面标志物[10]。当周围神经受损伤时，小胶质细胞会发生形态改变伴随OX42的表达增加，与神经病理性疼痛的发生密切相关[11]。越来越多的研究发现，小胶质细胞上的嘌呤能信号在神经病理性疼痛的发病机制中起着重要作用。在周围神经损伤后，小胶质细胞被激活，形态和功能发生变化，细胞数量增加，同时嘌呤P2X7受体基因表达上调[12-13]。P2X7受体是P2嘌呤能受体的一个亚型，感觉神经末梢释放的受体激动剂(包括ATP及其衍生物)可与P2X7受体结合，使感受器活化，介导疼痛的感觉和传导[14-15]，在炎症性疼痛和神经性疼痛的发展中都发挥着重要作用[16-17]。Wu等[18]认为，P2X7在神经病理性疼痛中充当内源性激动剂的作用。P2X7受体特异性阻滞剂(如a-438079和a-740003)可降低DNP大鼠的疼痛反应[19-20]。小鼠的P2X7受体基因被敲除后，小鼠对疼痛的超敏反应在神经损伤后消失[21]。此外，P2X7受体的高表达也能促进脊髓背角小胶质细胞CCL3的释放[22]。在对STZ诱导的DNP模型大鼠的研究发现，脊髓背角组织中CCL3和P2X7受体的高表达参与痛觉过敏的产生[23]。上述结果表明，P2X7受体参与神经病理性疼痛的产生，阻断P2X7受体的活化可能是缓解神经疼痛的有效方法。小胶质细胞中高表达的P2X7受体也在小胶质细胞激活和随后释放促炎细胞因子(包括IL-1β和TNF-α)中起关键作用[24]。大量实验证实慢性低度炎症在DNP的发生发展中起着极其重要的作用[5-6]。其中，TNF-α是参与糖尿病神经病变的关键炎症因子[25]。综上所述，降低P2X7的表达可以抑制炎症反应，发挥神经保护作用，缓解神经性疼痛。

本研究发现，DNP大鼠的机械痛阈和热缩足反应时间显著降低，脊髓小胶质细胞中OX42和P2X7表达水平显著增加，血清中炎症递质IL-1β、TNF-α和CCL3的水平也显著升高。这提示STZ诱导的糖尿病大鼠周围神经损伤后，脊髓内的小胶质细胞活性明显升高并伴随P2X7表达水平上调。益气活血通络方干预后，机械痛阈和热缩足反应时间显著升高，说明益气活血通络方确实能改善DNP模型大鼠周围神经的功能，缓解其疼痛症状。脊髓组织中OX42和P2X7表达水平降低，血清TNF-α、IL-1β和CCL3水平亦明显下降，说明益气活血通络方可通过降低小胶质细胞活性，下调P2X7的表达水平，抑制炎症因子和趋化因子的释放，从而改善周围神经损伤并减轻神经病理性疼痛。综合课题组前期和本次的研究结果，药物的剂量依赖性趋势并不显著[7]，还需进一步探索。

本实验研究了中药复方益气活血通络方防治DNP的功效和机制，为下一步通过网络药理学等方法进一步阐明益气活血通络方干预DNP提供了有效依据，为中医药治疗糖尿病并发症提供科学依据和有效选择。