芪白平肺胶囊通过抑制PI3K/Akt通路促进低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡

张 璐，童祥丽，王小乐，朱 洁，李泽庚，，3

(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中医药科学院中医呼吸病防治研究所，安徽 合肥 230031)

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是一种高致残率和死亡率的肺血管疾病[1]，亦是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的重要并发症，通常以轻度至中度肺血管重塑为特征，主要表现为肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)过度增殖与细胞外基质蛋白异常沉积导致的血管内壁增厚、腔径狭窄及阻力增加[2-3]。患者在疾病早期可无明显临床症状，中晚期右心室后负荷加重，有明显的呼吸困难症状及运动耐量降低，此时临床疗效较差，患者的生存率降低[4]。慢性低氧是HPH的主要诱因之一，其导致的肺血管重塑、收缩等在HPH的发病机制中具有重要作用[5]。研究[6]表明，肺血管重塑主要表现为平滑肌细胞异常增殖，与HPH严重程度密切相关。因此，调控PASMCs的异常增殖状态以缓解肺血管重塑是药物治疗HPH的潜在有效策略。

芪白平肺胶囊是安徽中医药大学第一附属医院的院内制剂，以益气化痰祛瘀立法。课题组前期研究表明，该方能有效改善COPD患者胸闷、气喘、呼吸困难等临床症状[7-8]，促进低氧诱导的大鼠PASMCs的凋亡[9]，减轻肺血管重构，但其主要作用的分子机制有待进一步研究。近年来的研究发现，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路在细胞增殖、凋亡等细胞功能调节方面发挥着重要的调控作用，该通路的激活或抑制影响下游凋亡相关因子的活性进而调节细胞凋亡。为此，本研究通过芪白平肺胶囊含药血清干预低氧诱导的大鼠PASMCs，观察其对PI3K/Akt通路关键分子的影响，以探究其治疗HPH可能的分子机制。

1 材料

1.1 动物 健康雄性清洁级SD大鼠，体质量(220±20)g，由山东省实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(鲁)2019-0003。饲养于安徽中医药大学动物实验中心，动物饲养室干净、通风，室内温度为(20±2)℃，湿度为(50±2)%，适应性饲养1周后用于实验。

1.2 药物 芪白平肺胶囊组方为黄芪、薤白、生晒参、川芎、葶苈子、五味子、地龙，由安徽中医药大学第一附属医院制剂室提供，批号为20190805。将芪白平肺胶囊调配成溶液，每毫升含芪白平肺胶囊50 mg。

1.3 试剂 PBS、DMEM高糖培养液：美国HyClone公司；胎牛血清(批号 2036224C)：美国Gibco公司；胰蛋白酶(批号 325043033)：维森特生物技术(南京)有限公司；兔抗α-SMA抗体(批号 82687)、FITC-羊抗兔 IgG(批号 20000235)：武汉三鹰生物科技有限公司；PI3K抑制剂(LY294002)：美国Selleck公司；DAPI：美国Sigma-Aldrich公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)：美国AbMole公司；兔抗AKT、p-AKT多克隆抗体：美国Abcam公司；兔抗Bcl-2、Caspase-3多克隆抗体：美国Santa cruz公司；山羊血清、TritonX-100：上海碧云天生物技术有限公司。

1.4 仪器 倒置显微镜(型号 CHL2FM3)：日本Olympus公司；多功能酶标仪(型号 BioTek Epoch 2)：美国BioTek公司；三气培养箱(型号 Series 8000 WJ)：Thermo Fisher Scientific公司。

2 方法

2.1 大鼠原代PASMCs提取 无菌条件下快速分离大鼠肺动脉，刮去其内膜与外膜，取中膜剪成约1 mm2组织块，平铺于含20%胎牛血清DMEM的25 mL培养瓶中，加入5 mL含20%胎牛血清DMEM培养液于瓶底，垂直放置在5% CO2、37 ℃培养箱中，4 h后缓慢放平培养瓶，使组织块得到充分浸润，3 d后换液，之后每2 d更换一次培养液，细胞密度达70%时采用α平滑肌肌动蛋白抗体进行免疫荧光鉴定，选用4～6代生长良好的PASMCs进行后续实验。

2.2 含药血清的制备 将雄性SD大鼠随机分成空白对照组与芪白平肺胶囊组，每组6只。芪白平肺胶囊组参照前期研究[6，10]予每日芪白平肺胶囊溶液灌胃1 g/kg，空白对照组予同容积生理盐水灌胃，每日2次，连续9 d。末次给药后1 h腹主动脉取血，静置2 h待血液凝固、血清析出后3 000 r/min低温离心15 min，无菌分离血清，56 ℃水浴30 min灭活补体，过滤后保存于-80 ℃冰箱。

2.3 含药血清浓度及时间的筛选 将4～6代细胞消化离心收集后以每孔1×104接种于96孔板，设立常氧组，低氧组，5%、10%、15%、20%芪白平肺胶囊含药血清组，每组设5个复孔。常氧组与低氧组加入空白对照组大鼠血清，分别在常氧培养箱(20% O2，5% CO2，75% N2)、三气培养箱(3% O2，5% CO2，92% N2)培养，其余各组加入芪白平肺胶囊含药血清，于三气培养箱中培养。各组分别培养6、12、24、48 h，结束后每孔加入10 μL的CCK-8溶液于37 ℃继续孵育1 h，酶标仪450 nm波长检测各孔吸光度(optical density，OD)值，空白孔调零，重复3次取平均值，计算细胞活力值。细胞活力=实验组OD值/对照组OD值×100%。

2.4 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡 取对数生长期的大鼠PASMCs，根据CCK-8结果随机分成常氧组与最佳含药血清组。待预处理细胞最佳低氧时间后，予4%多聚甲醛固定，PBS漂洗2次，加入0.5 mL Hoechst 33258染液，室温放置5 min，PBS漂洗2次后荧光显微镜下观察。

2.5 Western blot检测蛋白表达水平 取对数生长期的大鼠PASMCs，根据CCK8结果随机分成常氧组、低氧组、低氧+芪白平肺胶囊含药血清组、低氧+芪白平肺胶囊含药血清+LY294002组(终浓度为20 μmol/L)。待预处理细胞最佳低氧时间后，收集细胞样本，加入RIPA裂解液冰上裂解，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，收集上清液，在收集的蛋白样品中按照1∶4加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100 ℃煮10 min。SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗Akt、p-Akt、Caspase-3多克隆抗体(稀释度为1∶1 000)和Bcl-2多克隆抗体(稀释度为1∶500)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶20 000)室温孵育2 h后再次洗膜。使用ECL发光试剂盒显影，曝光后胶片用Image J软件处理。

3 结果

3.1 PASMCs的鉴定 FITC标记的α平滑肌肌动蛋白呈纤维细丝状，发绿色荧光，经DAPI染色后的细胞核呈蓝色荧光。见图1。

图1 PASMCs免疫荧光鉴定图

3.2 最佳低氧时间、最佳含药血清浓度的筛选 低氧培养不同时间后，各时间段PASMCs的活力比较，差异有统计学意义(P<0.05)，24 h的细胞活力值最高，故后续选取24 h作为低氧刺激时间。与低氧组比较，各芪白平肺胶囊含药血清组细胞活力均显著降低(P<0.05)，后续选取20%含药血清组作为含药血清浓度。见图2。

注：A.低氧组；B.5%芪白平肺胶囊含药血清组；C.10%芪白平肺胶囊含药血清组；D.15%芪白平肺胶囊含药血清组；E.20%芪白平肺胶囊含药血清组；与低氧6 h组比较，*P<0.05；与低氧组比较，#P<0.05

3.3 Hoechst 33258染色法观察给药后PASMCs凋亡情况 PASMCs经Hoechst 33258染色后呈正常蓝色，芪白平肺胶囊含药血清组经药物干预24 h后，细胞核发出蓝色强光，出现染色质固缩、核碎裂的细胞凋亡现象。见图3。

注：A.常氧组；B.低氧+20%芪白平肺胶囊含药血清组

3.4 芪白平肺胶囊含药血清对PASMCs中p-Akt、Akt及凋亡相关蛋白表达水平的影响 与常氧组比较，低氧组p-Akt、Bcl-2表达水平升高，Caspase-3表达水平降低(P<0.05)；与低氧组比较，低氧+芪白平肺胶囊含药血清组p-Akt、Bcl-2表达水平降低，Caspase-3表达水平升高(P<0.05)；与低氧+芪白平肺胶囊含药血清组相比，低氧+芪白平肺胶囊含药血清+LY294002组p-Akt、Bcl-2表达水平降低，Caspase-3表达水平升高(P<0.05)。见图4。

图4 芪白平肺胶囊含药血清对p-Akt、Akt及凋亡相关蛋白表达水平的影响

4 讨论

HPH在中医古籍中并无记载，依据临床表现可将其归属于中医“肺胀”范畴，乃本虚标实之证，“虚、痰、瘀”是其核心病机[11]。肺气亏虚累及肾与脾，内生痰饮致气道不利，浊气郁积形成瘀血；瘀而气滞，无力行津，化生为痰，或瘀阻脉道致津溢脉外积久成痰，痰瘀互结，互为因果。方中黄芪、生晒参补脾益肺，川芎行气活血，薤白理气通阳，葶苈子泻肺平喘，地龙清肺定喘，五味子滋补肾阴、敛降肺气。诸药合用，共奏益气温阳、化痰祛瘀之功。PASMCs的异常增殖是引起肺血管重塑、导致HPH发生的重要原因。本实验研究发现，芪白平肺胶囊含药血清可显著促进低氧诱导的大鼠PASMCs凋亡，提示其可能通过凋亡途径，改善低氧诱导的PASMCs异常增殖。为此，笔者进一步观察了芪白平肺胶囊对低氧诱导的大鼠PASMCs凋亡相关蛋白的影响。

研究[12-13]表明，Bcl-2家族蛋白与细胞凋亡机制密切相关，其中抗凋亡蛋白Bcl-2的异常表达是凋亡发生的一个关键因素。位于膜表面的Bcl-2有调节线粒体通透性转运孔开放的作用，在凋亡信号刺激下，Bcl-2的异常表达促使其不可逆的过度开放，破坏细胞膜完整性，释放出促凋亡因子。Caspase家族启动级联反应，最终导致细胞凋亡的发生[14-15]。其中Caspase-3蛋白是凋亡的最终执行者，有终止DNA修复的功能。本研究结果表明，大鼠PASMCs低氧24 h后的Bcl-2蛋白表达水平显著升高，Caspase-3蛋白表达水平明显降低。而芪白平肺胶囊含药血清处理后Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Caspase-3蛋白表达水平明显升高，这表明芪白平肺胶囊含药血清通过调控凋亡相关蛋白表达来促进低氧诱导的PASMCs凋亡。

PI3K/Akt信号通路的激活或抑制与血管生成密切相关[16-17]，活化的PI3K可部分或完全激活下游靶点Akt，活化的Akt影响下游Bcl-2家族蛋白及Caspase-3等蛋白的活性，进而调节细胞的增殖与凋亡[18-19]。多项研究表明，PI3K/Akt通路参与改善肺血管重构。Zhang等[20]指出，PI3K/Akt信号通路参与化合物香芹酚促进低氧条件下PASMCs凋亡、减弱肺血管重构的过程。Xia等[21]发现，赖氨酰氧化酶的表达在低氧诱导的肺动脉高压大鼠中呈现出PI3K/Akt依赖性，给予抑制剂处理后肺血管重构得到明显改善。Chen等[22]证实，中药卷柏分离出的有效活性成分总黄酮，通过PI3K/Akt信号通路逆转慢性低氧引起的气道平滑肌细胞过度增殖与凋亡减少。本研究结果表明，低氧组PASMCs中p-Akt值高于常氧组，表明低氧激活HPH中PI3K/Akt信号通路。低氧+芪白平肺含药血清组较低氧组p-Akt表达水平降低，低氧条件下芪白平肺含药血清+LY294002组p-Akt表达水平较不使用抑制剂组下降，且抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显下降，促凋亡蛋白Caspase-3表达水平显著上调。这表明芪白平肺胶囊含药血清可能通过抑制低氧状态下PI3K/Akt信号通路的激活，部分逆转低氧条件下PASMCs凋亡的减少，改善HPH中肺血管重构。

综上所述，芪白平肺胶囊含药血清对低氧大鼠PASMCs凋亡有明显的促进作用，该作用由PI3K/Akt信号通路介导。