柠檬酸对犊牛生长性能、养分表观消化率及血液生化指标的影响

王姗姗 ， 沈宜钊 ， 李 妍 ， 高艳霞 ， 李建国

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2.河北农业大学动物医学院，河北保定 071001）

腹泻是犊牛的常见疾病， 也是造成牧场经济损失的主要原因之一（Windeyer 等，2014；Soberon等，2012）。抗生素可以有效缓解犊牛腹泻，提高犊牛的生长性能， 但抗生素滥用产生的耐药性和残留问题不可忽视。我国自2020 年开始全面禁止促生长类抗生素的使用，因此，寻找抗生素替代物的研究成为热点。 酸化剂是一种无残留、无抗药性、无毒副作用的饲料添加剂， 也是目前动物养殖常用的抗生素替代物之一。 柠檬酸是一种有机酸化剂，许多研究表明，有机酸可以降低消化道的pH，增加乳酸菌和双歧杆菌的数量，减少大肠杆菌，促进动物肠道形态的发育， 从而提高动物的生长性能 和 营 养 消 化 能 力 （Long 等 ，2018；Zhai 等 ，2017）。 育肥羊饲粮中添加柠檬酸钠，可显著提高羔羊日增重和饲料利用率（Packett 等，1963）。 西门塔尔牛日粮中添加柠檬酸， 可显著改善其对精料的消化率（孟杰等，2008）。 目前，对柠檬酸的研究主要集中于仔猪和肉鸡， 缺乏对犊牛的相关研究。 因此，本试验旨在探究开食料中添加柠檬酸对犊牛生长性能、养分表观消化率、血清生化指标的影响， 为犊牛生产实践中酸化剂的应用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 食品级一水柠檬酸， 为白色颗粒（纯度≥99.9），购置于山东潍坊英轩实业有限公司。

1.2 试验设计及日粮 本试验于2021 年1 ～5月进行。 选择初生重相近的健康荷斯坦犊牛44头，随机分为4组，每组11 头，各组间平均初生重差异不显著（P ＞ 0.05）。对照组（CON组）饲喂基础饲粮，CA1、CA2、CA3组在基础饲粮中分别添加 0.5、1.0、1.5 g/d·头的柠檬酸。试验期 56 d。试验牛从3 日龄开始补饲开食料，5 日龄开始在犊牛开食料中添加柠檬酸。 开食料营养水平如表1。

表1 开食料营养水平（风干基础） %

1.3 饲养管理 试验犊牛出生后转移至犊牛岛，灌服4 L 初乳，单栏饲养，自由饮水。 每天早上6：00 和下午17：00 各饲喂一次。 犊牛出生后的第1周每天每头饲喂巴氏杀菌乳4 L，第2 ～4 周每天每头饲喂6 L，第5 ～6 周每天每头饲喂9 L，第7～8 周逐渐递减至每天每头饲喂5 L。 试验期间定期清理犊牛圈舍，保持圈舍整洁干燥。

1.4 指标测定与方法

1.4.1 体尺体重 分别于试验开始 （1 日龄）和试验结束（56 日龄）晨饲前称量犊牛体重，计算1～56 日龄平均日增重（ADG）；并用测仗和卷尺测定体高、体斜长、胸围和管围。

1.4.2 采食量和腹泻率的测定 试验期间每天记录每头犊牛开食料投料量和剩料量， 计算犊牛采食量。每日观察犊牛粪便状态，参考粪便评分标准（表2） 对犊牛的粪便进行评分， 当犊牛粪便评分≥3 时记为腹泻。 每头犊牛每腹泻1 d 记为腹泻1 次，计算犊牛腹泻率。

表2 粪便评分标准

腹泻率/%=（腹泻头数/总头数）×100。

1.4.3 饲料和粪便样品营养成分的测定 每天称量并记录每头试验牛开食料投料量及剩料量，用于测定犊牛每日的采食量。 收集犊牛剩余开食料300 ～ 500 g， 于 65 ℃烘干 48 h， 并粉碎过 2 mm和0.425 mm 筛（分别用于纤维和其他养分测定），置于封口袋内保存，用于营养成分含量的测定。 于犊牛51 ～56 日龄， 每组随机选取8 头牛收集粪便样品，将每天收集的粪便混合，每头牛收集300 g粪便样品，于65 ℃烘干48 h，制成风干样品（粉碎过2 mm 和0.425 mm 筛），置于封口袋内保存，用于干物质（DM）、粗脂肪（EE）、钙（Ca）、磷（P）、粗灰分（ASH）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）含量的测定。 另外，收集 200 g 粪便样品（按每100 g 新鲜粪便加入20 mL 浓度为10%的H2SO4进行处理，充分混匀），于 65 ℃烘干 48 h，粉碎过0.425 mm 筛，用于测定粗蛋白质（CP）。

饲料和粪便样品 DM、EE、Ca 与P 的含量参照张丽英（2007）实验室常规分析方法测定，CP 含量的测定参照国标（GB/T 6432-2018），利用FOSS全自动蛋白测定仪（美国）进行测定。NDF 与ADF的测定参照Van Soest 等（1991）的方法用全自动纤维仪 ANKOM-A2000i（美国）测定。ASH 参照国标（GB/T 6438-2007）进行测定，有机物（OM）=100%-ASH。 酸不溶灰分参照国标（GB/T 23742-2009）用4N-HCL 法进行测定。

1.4.4 营养物质表观消化率 用酸不溶灰分法计算饲料中各养分物质的表观消化率。 计算公式如下：

某养分消化率/%＝（a/c-b/d）/（a/c）×100；

式中：a 为饲料中某养分，%；b 为粪中某养分，%；c 为饲料酸不溶灰分，%；d 为粪中酸不溶灰分，%。

1.4.5 血液指标测定 56 日龄时，每组选取8 头犊牛， 晨饲前通过颈静脉采集血液样品约20 mL置于促凝剂管中，3000 r/min 离心15 min，取上层血清分装于0.5 mL 离心管中，-20 ℃保存待测。血清中总蛋白 （TP）、 白蛋白 （ALB）、 总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。 丙二醛（MDA）和总抗氧化能力（T-AOC）采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定，试剂盒购自于北京华悦昌生物科技有限公司。 所用酶标仪DNM-9602（中国）购自于北京普朗新技术有限公司。

1.5 统计分析 采用SAS 9.4 软件的 PROC MIXED 模型进行数据分析， 其中， 处理是固定效应，犊牛是随机效应。 在LSMEANS 语句中包含用Tukey 方法调整的PIDFF 选项，以说明F 检验显著时处理间的多重比较。 采用contrast 语句对柠檬酸添加量的线性、二次和三次效应进行分析。 试验结果以“平均值和标准误”表示，P ≤0.05 为组间差异显著，0.05＜P ≤0.10 表示组间差异有趋势。 犊牛腹泻率采用PROC GLIMMIX 模型进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 柠檬酸对犊牛生长性能的影响 由表3 可知，随着柠檬酸添加量增加，各组犊牛断奶体重呈二次上升趋势（P =0.06）；平均日增重二次升高（P＜0.05），CA2组犊牛平均日增重显著高于CON组（P ＜ 0.05），较对照组提高了 8.53%，与 CA1 和CA3组无显著差异（P ＞ 0.05）。 由表 4 可知，1 日龄时， 各组犊牛的体尺性状均无显著差异 （P ＞0.05），说明各组间犊牛体型差异不大。56 日龄时，随着柠檬酸添加量的增加，犊牛体高二次升高（P ＜0.05），体斜长呈线性上升趋势（P ≤0.10），胸围和管围没有显著差异（P ＞ 0.05）。

表3 饲喂柠檬酸对犊牛体重的影响

表4 饲喂柠檬酸对犊牛体尺性状的影响 cm

2.2 柠檬酸对犊牛颗粒料采食量的影响 由表5可知， 柠檬酸的添加对第1 周和第3 周犊牛采食量无影响。但随柠檬酸添加量的增加，第2 周和第8 周犊牛采食量呈线性上升趋势（P ＜0.10）；第4和第 7 周犊牛采食量线性升高（P ＜ 0.05）；第 5 周犊牛采食量线性升高（P ＜0.05），与对照组相比，CA1、CA2 和CA3组犊牛采量分别提高了14%、17.2%和14.6%；第6 周犊牛采食量二次升高（P ＜0.05），CA2组犊牛采食量显著高于 CON组，较CON组提高了16.4%。 从全期来看，各组犊牛采食量二次升高 （P ＜ 0.05），CA2组犊牛采食量最高，较CON组提高了13.2%。

表5 柠檬酸对犊牛开食料采食量的影响 g/d

2.3 柠檬酸对犊牛腹泻频率的影响 由表6 可知，不管是各试验周还是整个试验期，各组犊牛的腹泻率均无显著差异（P ＞0.05）。

表6 柠檬酸对犊牛腹泻率的影响 %

2.4 柠檬酸对犊牛营养物质表观消化率的影响由表 7 可知，柠檬酸添加对EE、ADF 和 P 的消化率均无显著影响（P ＞0.05）。但随柠檬酸添加量的增加，DM、OM、CP 及 NDF 消化率线性升高 （P ＜0.05），其中，与对照组相比，CA1、CA2 和 CA3组犊牛 NDF 消化率分别提高了 10.3%、15.1%和17.9%，Ca 的消化率呈二次上升趋势（P =0.08）。

表7 柠檬酸对犊牛营养物质表观消化率的影响 %

2.5 柠檬酸对犊牛血液生化指标的影响 由表8可知， 柠檬酸添加对各组犊牛血清生化指标均无显著影响（P ＞ 0.05），但血清 TP 浓度随柠檬酸添加量增加呈二次上升的趋势（P =0.08）。

表8 柠檬酸对犊牛血液生化指标的影响

3 讨论

3.1 柠檬酸对犊牛生长性能的影响 柠檬酸作为一种日粮中常见的酸化剂， 具有良好的调味功能， 有研究认为日粮添加柠檬酸能够有效提高多种动物的采食量。 Chavez 等（2013）在柳枝稷和苜蓿干草中添加10 g/kg 柠檬酸，可提高肉牛干草的摄入量。李卓卿（2005）研究发现，柠檬酸与苹果酸联用能提高奶牛对低质粗饲料的采食量。 本试验结果表明， 柠檬酸可以显著提高犊牛颗粒料采食量，与前人研究结果一致，说明柠檬酸可能改善了开食料的风味和适口性， 进而促进了犊牛的采食量；犊牛全期采食量有二次升高趋势，以1.0 g/d组犊牛采食量最高，表明柠檬酸添加需要适量，高浓度剂量添加可能会降低饲粮适口性。 Packett 等（1963）在以谷物高粱、棉籽粕、甘蔗糖蜜、紫花苜蓿和棉籽壳为基础日粮的羔羊育肥试验中， 添加3%的柠檬酸钠可显著提高羔羊的采食量及饲料利用率，进而提高羔羊日增重。Kazemi-bonchenari等（2017）研究发现，荷斯坦犊牛补饲柠檬酸处理大麦可以显著提高日增重。本试验中，与对照组相比， 添加1.0 g/d 柠檬酸组犊牛日增重显著提高，与前人结果一致。 同时犊牛体高和体斜长也有一定的增长，可能是柠檬酸提高了犊牛采食量，增加了营养物质的摄入， 进而提高了断奶前犊牛的生长性能。

3.2 柠檬酸对犊牛腹泻率的影响 柠檬酸作为一种有机酸化剂，具有良好的替抗作用。 Lingyan等（2019）研究发现，酸化乳可以降低犊牛腹泻率，可能与酸化乳引起的肠道pH 降低以及细菌总数和大肠杆菌数量的减少有关。 高岩等（2020）研究也发现，酸化乳可通过调节肠道菌群平衡，降低犊牛腹泻率，改善粪便评分。 此外，断奶仔猪上的研究也证明饲粮中添加适量柠檬酸可通过酸化日粮降低仔猪胃肠道内的pH，增加乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌的数量，抑制沙门氏菌、大肠杆菌等致病菌的生长繁殖，改善仔猪肠道微生态环境， 从而达到有效防治腹泻的目的（严欣茹等，2020；姚继明等，2017；张淑琴，2016），说明柠檬酸进入幼龄动物肠道具有降低肠道pH，改善微生物菌群结构，进而缓解腹泻的作用。 本研究中，柠檬酸直接添加入开食料中，并不经食管沟进入真胃和肠道， 而是直接在瘤胃参与微生物发酵， 因此本研究中柠檬酸对犊牛腹泻没有显著影响。

3.3 柠檬酸对犊牛营养物质表观消化率的影响酸化剂可通过酸化日粮，降低消化道pH，提高某些蛋白酶活性，从而提高饲料消化利用率（肖军，2020； 潘宝海等，2019）。 Kazemi-bonchenari 等（2017）研究发现，犊牛饲喂柠檬酸处理后的大麦日粮，对OM 和NDF 的消化率有提高的趋势。孟杰等（2008）研究表明，西门塔尔牛日粮添加200 g/d柠檬酸可显著提高对精料 DM、EE、NDF 和 ADF的消化率。 本试验中，随着柠檬酸添加量增加，犊牛 DM、OM、CP 和 NDF 消化率线性升高， 且 1.5 g/d柠檬酸组犊牛消化率最好，表明柠檬酸在一定程度上可以促进犊牛对营养物质的消化吸收。 李成良等（2007）在生长猪研究中发现，柠檬酸有进一步提高植酸酶对植酸磷的消化和对钙磷利用的趋势。 本试验中，Ca 的消化率有二次上升的趋势，与前人研究结果一致。

3.4 柠檬酸对犊牛血液生化指标的影响 血清生化指标的变化，可以反映动物生长、代谢情况。TP 和ALB 由肝脏合成， 可以反映机体蛋白的代谢水平。朱孟玲等（2010）研究发现，柠檬酸可显著提高断奶仔猪TP 水平。 本试验中，血清TP 含量有二次上升的趋势， 这与犊牛试验前期采食量增加及CP 消化率显著提高的趋势相吻合， 表明柠檬酸可以提高日粮蛋白质的利用， 并对蛋白质的合成代谢产生积极作用。GLU、TG 和TC 是能量代谢的重要指标， 本试验中柠檬酸添加对犊牛血清GLU、TG 和TC 含量变化没有显著影响，说明柠檬酸在犊牛对糖的吸收运转以及能量代谢方面的影响不大。 ALT 和AST 是肝脏损伤的重要指标，当肝脏细胞发生氧化损伤时，ALT 和AST 活性增强。 张之迎等（2010）在延边半细毛羊日粮中添加有机酸，ALT 和AST 活性均在合理范围内， 不会对肝脏组织产生危害。 本试验中， 柠檬酸的添加对犊牛ALT 和AST 活性均无显著影响，与前人研究结果一致， 说明柠檬酸不会对肝脏产生不良影响。 MDA 和T-AOC 是反映机体抗氧化能力的重要指标。 李建平等（2009）研究表明，添加柠檬酸可显著提高断奶仔猪血清T-AOC 水平。 在本试验中，各组犊牛 T-AOC 水平与MDA 含量均无显著差异，与前人研究结果不同，可能与动物品种、酸化剂种类及使用剂量等不同有关。

4 结论

犊牛开食料中添加柠檬酸， 虽然对腹泻率没有显著影响，但是可以显著提高犊牛采食量，改善营养物质表观消化率，进而促进犊牛的生长发育。综上，本试验条件下，犊牛饲粮中柠檬酸的建议添加量为 1.0 ～ 1.5 g/d·头