地骨皮乙素对低温爆震肺氧化应激损伤影响研究

孙久惠， 刘 颖， 丛培芳， 史秀云， 马瑞珩， 金红旭

1.锦州医科大学研究生培养基地，辽宁 沈阳 110016；2.北部战区总医院 急诊医学科，辽宁 沈阳 110016

低温环境应激反应可影响呼吸系统，氧化应激、炎症反应、细胞凋亡与系统损伤活动有关[1]。肺作为空腔脏器，是爆震发生时最易受损的器官之一。因此，明确低温爆震对肺的影响并寻找有效的救治药物具有重要意义。地骨皮为茄科植物枸杞或宁夏枸杞的干燥根皮，含有生物碱类、有机酸及酯类、苯丙素类、蒽醌类、柳杉酚、东莨菪素等成分[2]。地骨皮具有抗细菌和真菌、免疫调节、降血压、解热、降血脂和血糖等多种药理作用[3]。有研究认为，地骨皮提取物能够抑制体内氧自由基的产生，增强抗氧化能力，加速自由基的清除[4]。本研究旨在探讨地骨皮提取物地骨皮乙素对低温爆震肺氧化应激损伤的影响及机制，为更有效地利用地骨皮提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 24只雄性C57/BL小鼠购自辽宁长生生物科技有限公司。地骨皮乙素购自上海源叶生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒和丙二醛(malonaldehyde，MDA)试剂盒均购自辽宁汇佰生物科技有限公司。实验设计得到北部战区总医院动物伦理委员会许可。

1.2 模型建立 将小鼠随机分入对照组、模型组、地骨皮乙素组，每组各8只。地骨皮乙素组灌胃给予地骨皮乙素4.0 g/kg，每天1次，连续4周；对照组和模型组分别灌胃给予等体积生理盐水。小鼠均饲养于SPF级实验室，温度维持在(22±3)℃，湿度维持在45%～65%，自由饮食饮水。适应性饲养7 d后，-20℃、湿度15%恒温箱中低温饲养7 d，禁水不禁食，每8小时观察小鼠状态并喂食，建立低温损伤模型。7 d后采用自主设计研发的高仿真爆震伤模拟装置建立低温爆震伤致小鼠肺损伤模型(模型组和地骨皮乙素组)，具体方法参考文献[4]。

1.3 湿干重检测 10%水合氯醛麻醉C57/BL小鼠，快速取得肺组织，滤纸擦去表面水分，置于已烤干并称重(重量为W)的载玻片上称重并记录(W1)，然后置于60℃烘箱内烘烤24 h，间隔15 min重复称重以取得恒重并记录(W2)。

组织含水量(%)=(W1-W)/(W2-W)×100%

1.4 酶联免疫吸附试验 将组织标本进行蛋白提取后，从已平衡至室温的密封袋中取出板条和试剂。标准品孔和加样孔均按照说明书操作。按顺序加入工作液和孵育，显色并终止后450 nm下测量光密度值。

1.5 反转录酶-聚合酶链锁反应 Trizol reagent提取组织总RNA。取4.0 μg总RNA，65℃变性5 min，经AMV逆转录酶42℃逆转录30 min，合成cDNA。取5 μl cDNA产物，依次加入10×PCR缓冲液、上下游引物各50 pmol、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、Taq DNA poly-merase 1 U。以下列条件进行扩增：94℃ 3 min，94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s。进行30次循环后进一步延伸，72℃ 5 min。

1.6 Western-blot 分别进行组织蛋白提取和总蛋白测定后，将蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至PVDF膜上，室温封闭1 h，分别用一抗4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，加入相对应二抗室温孵育1 h。TBST漂洗3次，采用ECL Western印迹试剂盒进行化学发光检测。

2 结果

2.1 各组小鼠肺组织含水量比较 与对照组比较，模型组小鼠肺组织含水量升高(P<0.05)；与模型组比较，地骨皮乙素组小鼠肺组织含水量降低(P<0.05)。见图1。

图1 各组小鼠肺组织含水量比较

2.2 各组小鼠氧化应激相关指标比较 对照组、模型组、地骨皮乙素组小鼠SOD1分别为(222±13)pg/ml、(731±29)pg/ml、(253±18)pg/ml，SOD2分别为(112±8)U/ml、(211±12)U/ml、(121±11)U/ml，MDA分别为(235±17)nmol/ml、(669±22)nmol/ml、(238±15)nmol/ml。模型组小鼠SOD1、SOD2、MDA水平均高于对照组(P<0.05)，地骨皮乙素组小鼠SOD1、SOD2、MDA水平均低于模型组(P<0.05)。

2.3 各组小鼠Nrf2、Keap1、ARE mRNA表达水平比较 对照组、模型组、地骨皮乙素组小鼠Nrf2 mRNA分别为1、(4.40±0.57)、(1.30±0.28)，Keap1 mRNA分别为1、(3.20±0.34)、(1.50±0.31)，ARE mRNA分别为1、(2.20±0.14)、(1.30±0.17)。模型组小鼠Nrf2、Keap1、ARE mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05)，地骨皮乙素组小鼠Nrf2、Keap1、ARE mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05)。

2.4 各组小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表达水平升高(P<0.05)；与模型组比较，地骨皮乙素组小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图2。

图2 各组小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表达水平比较

3 讨论

在爆震伤损伤动物模型中，C57/BL小鼠具有结果精确度高、可比性好、价格低廉、血量丰富、免疫系统完善、应激反应均一、器官发育完全等优点，因此，本研究选用C57/BL小鼠建立低温爆震肺损伤模型。作为呼吸系统的主要器官，肺对寒冷环境和冲击波的反应变化非常敏感，主要表现为肺内氧气弥散和氧合效果明显降低。在低温爆震损伤后，肺部的病理变化主要表现为：大量中性粒细胞导致肺部炎症反应，肺内毛细血管膜通透性增加，出现肺组织水肿，以及由于血管内皮受损而形成的血栓和出血[5-6]。细胞凋亡是导致肺损伤的重要原因，细胞内活性氧水平升高是低温加速细胞凋亡的细胞学表现[7-8]。本研究结果显示：低温爆震肺损伤发生后，小鼠肺组织湿干重增加，血清氧化应激相关指标改变，Nrf2、Keap1、ARE mRNA和蛋白表达水平升高；而地骨皮乙素干预能够有效降低小鼠湿干重，减少氧化应激蛋白，改善低温爆震肺损伤，且其机制与通过Nrf-Keap1-ARE通路调节细胞氧化应激有关。

Nrf2是一种转录因子，可通过调节一系列抗氧化和细胞应激基因来对抗氧化应激，在调控寿命和衰老进程氧化应激损伤等防御机制中起着非常重要的作用[9]。当细胞受到氧化应激时，Keap1蛋白的构象发生改变，与Nrf2的结合减弱，削弱了靶向Nrf2的泛素化修饰和降解，从而使更多新合成的Nrf2转移入核，结合到相应靶基因启动子的ARE序列上，激活下游抗氧化损伤基因转录。除Nrf-Keap1-ARE通路外，Nrf2作为抗氧化应答中最核心的转录因子之一，还能够参与非Keap1依赖的抗氧化损伤途径[10]，激活Nrf2可介导下游的一系列抗氧化酶相关基因和蛋白，从而抑制氧化损伤，维持细胞氧化还原平衡。有研究报道，地骨皮乙素能够作用于Nrf-Keap1-ARE通路，在多种疾病中发挥有效作用[11]。

综上所述，地骨皮乙素能够有效改善低温爆震损伤小鼠肺组织的氧化应激损伤，机制与调节Nrf-Keap1-ARE通路有关。