表没食子儿茶素没食子酸酯对低氧环境下肺心病大鼠呼吸衰竭的改善作用

汪洋 张辉 伍冬冬 王圆方 刘帅 马东波 邓翔 吴秋歌

郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科（郑州450052）

肺心病是由于支气管-肺、胸廓或肺动脉发生病变，引起肺循环阻力增加，导致肺动脉高压和右心室肥大的一种疾病［1］。肺动脉高压引起肺血管重塑是肺心病发病的主要病理基础，临床以右心室肥厚及功能不全为主要特征，发病过程中肺部持续性、进展性气流受限，导致患者出现严重通气功能障碍，最终引起呼吸衰竭，严重影响患者生命安全［2］。

茶叶系山茶科植物茶树的干燥嫩叶或叶芽，是一种传统的药食同源的天然保健饮品。茶叶中含有咖啡碱、茶多酚、维生素类、矿物质、氨基酸和脂多糖等物质，其中茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶叶的主要生理活性成分［3］。近年来，大量研究发现，茶多酚具有抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化、强心、抗心律失常、抗衰老和抗菌等多种生物活性，并且揭示这些生物活性均与其抗氧化作用有关［4-5］。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）为茶多酚中主要的活性成分。研究［6-7］表明，EGCG 能抑制低氧引起的肺动脉平滑肌细胞增殖，并通过KLF-4∕MFN-2∕p-Erk信号通路抑制低氧诱导的肺动脉高压和右心室重构，提示EGCG 对右心功能不全引起的呼吸衰竭具有改善作用。

鉴于EGCG 对肺动脉高压形成可能的干预作用，本研究采用不同剂量的EGCG，探讨其对低氧环境下肺心病大鼠呼吸衰竭的改善作用，为开发治疗肺心病的药物提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠50 只，7 周龄，平均体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。大鼠购入后保持温度（23±2）℃，湿度（50±5）%，明暗周期12 h∕12 h 循环，适应性饲养1 周。本动物实验经郑州大学动物伦理学委员会审核批准（编号：syxk2017-221）。

1.1.2 药物、主要试剂和仪器 EGCG（美国Sigma公司），盐酸纳洛酮注射液（10 mL：4 mg，国药准字：H20064788，北京凯因科技股份有限公司），大鼠白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒（美国R&D 公司），G-100 血气分析仪（深圳市西尔曼科技有限公司），SCIREQ 小动物肺功能检测仪（北京广源达科技发展有限公司），DYCP-31DN 电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 建模、分组及干预方法 将50 只大鼠，随机分为正常对照组、模型组、EGCG 低剂量组、EGCG高剂量组和阳性对照组，每组各10 只。除健康组外，其余4 组大鼠建立肺心病模型［5］：将大鼠置于常压低氧舱内，舱内通过充入氮气，使氧气浓度保持在8%～11%，用无水CaCl2和碱石灰吸收舱内水分和CO2，使CO2浓度低于3%，4 组大鼠每天置于舱内8 h，每周6 d，共计4周。根据动物与人体等效剂量换算，模型组、EGCG 低剂量组、EGCG 高剂量组和阳性对照组大鼠分别于每天入仓前30 min 腹腔注射0.5 mL 生理盐水、10 mg∕kg EGCG、50 mg∕kg EGCG、1.0 mg∕kg 盐酸纳洛酮注射液。正常对照组大鼠不入舱，腹腔注射生理盐水0.5 mL∕只，每天1 次，每周6 天，共干预4 周。

1.2.2 肺功能相关指标检测 末次干预后12 h，使用小动物肺功能检测仪检测各组大鼠肺功能相关指标，记录大鼠呼吸频率、呼气阻力、呼气峰流速值（peak expiratory flow，PEF）和50%肺活量时最大呼气流量（50%forced expiratory flow，FEF50）。

1.2.3 动脉血气相关指标及血清IL-8、TNF-α 水平检测 肺功能检测结束后，采用3%戊巴比妥钠（40 mg∕kg）腹腔注射麻醉大鼠，股动脉采血，3 500 r∕min（离心半径10 cm）离心10 cm，取血清，一部分血清使用全自动血气分析仪检测氢离子浓度（pH）、氧分压（PaO2）、二氧化碳分压（PaCO2）。一部分血清采用酶联免疫分析法检测血清中IL-8、TNF-α 水平，反应结束后使用酶标仪在450 nm 波长读取吸光度值，根据标准曲线计算血清中IL-8、TNF-α 水平。

1.2.4 血流动力学及右心室肥厚情况检测 采血结束后，将大鼠仰卧固定，颈部备皮后正中部切口，分离颈部右侧皮肤，游离颈外静脉，结扎远心端，行右心室插管术，记录大鼠肺动脉压力和颈总动脉压力波形，检测平均肺动脉压（mean pressure of pulmonary artery，mPAP）和平均颈动脉压（mean carotid artery pressure，mCAP）。处死大鼠，迅速开胸，取出心脏，生理盐水冲洗干净后，分离右心室（RV）和左心室+室间隔（LV+S），分别称重后，计算右心指数，右心指数（%）=RV∕LV+S。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两样本比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺功能相关指标水平 呼吸频率、呼气阻力、PEF、FEF50 水平组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组比较，模型组、EGCG 低剂量组、EGCG 高剂量和阳性对照组呼吸频率、PEF、FEF50 水平降低，呼气阻力升高（P＜0.05）；与模型组比较，EGCG 低剂量组、EGCG 高剂量组和阳性对照组呼吸频率、PEF、FEF50 水平升高，呼气阻力降低（P＜0.05）；与EGCG 低剂量组比较，EGCG 高剂量组和阳性对照组呼吸频率、PEF、FEF50 水平升高，呼气阻力降低（P＜0.05）。EGCG高剂量组与阳性对照组呼吸频率、呼气阻力、PEF、FEF50水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肺功能指标水平比较Tab.1 Comparison of lung function index levels of rats in each group ±s

表1 各组大鼠肺功能指标水平比较Tab.1 Comparison of lung function index levels of rats in each group ±s

注：与正常对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与EGCG 低剂量组比较，cP ＜0.05

组别正常对照组模型组EGCG低剂量组EGCG高剂量组阳性对照组F值P值呼吸频率（次∕min）92.33±7.55 48.35±5.43a 61.25±6.91ab 79.47±7.62abc 81.59±7.97abc 50.759＜0.001呼气阻力［cmH2O∕（L·s）］1.47±0.23 2.33±0.31a 1.79±0.18ab 1.68±0.21abc 1.53±0.12abc 26.114＜0.001 PEF（L∕s）44.32±4.17 29.03±2.96a 33.46±3.19ab 37.98±4.52abc 38.86±3.76abc 17.327＜0.001 FEF50（L∕s）43.65±5.01 26.87±2.36a 30.94±4.37ab 38.17±4.03abc 37.64±3.62abc 27.421＜0.001

2.2 动脉血气指标水平 pH、PaO2、PaCO2水平组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组比较，模型组、EGCG 低剂量组、EGCG 高剂量和阳性对照组pH、PaO2水平降低，PaCO2水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，EGCG 低剂量组、EGCG高剂量组和阳性对照组pH、PaO2水平升高，PaCO2水平降低（P＜0.05）；与EGCG 低剂量组比较，EGCG 高剂量组和阳性对照组pH、PaO2水平升高，PaCO2水平降低（P＜0.05）。阳性对照组pH、PaO2水平略高于EGCG 高剂量组，PaCO2水平略低于EGCG 高剂量组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠动脉血气指标水平比较Tab.2 Comparison of arterial blood gas index levels of rats in each group ±s

表2 各组大鼠动脉血气指标水平比较Tab.2 Comparison of arterial blood gas index levels of rats in each group ±s

注：与正常对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与EGCG 低剂量组比较，cP ＜0.05

组别正常对照组模型组EGCG 低剂量组EGCG 高剂量组阳性对照组F 值P 值pH 7.37±0.08 5.51±0.42a 6.09±0.59ab 6.82±0.61abc 6.85±0.69abc 14.375＜0.001 PaO2（mmHg）122.47±14.71 69.25±7.46a 83.53±11.37ab 105.74±11.33abc 106.18±12.54abc 40.355＜0.001 PaCO2（mmHg）39.51±4.26 60.25±6.53a 51.53±4.72ab 44.38±4.27abc 43.62±4.87abc 30.643＜0.001

2.3 血清IL-8、TNF-α 水平 血清IL-8、TNF-α 水平组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组比较，模型组、EGCG 低剂量组、EGCG 高剂量和阳性对照组血清IL-8、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，EGCG 低剂量组、EGCG高剂量组和阳性对照组血清IL-8、TNF-α 水平降低（P＜0.05）；与EGCG 低剂量组比较，EGCG 高剂量组和阳性对照组血清IL-8、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。EGCG 高剂量组与阳性对照组血清IL-8 和TNF-α 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-8、TNF-α 水平比较Tab.3 Comparison of serum IL-8 and TNF-α levels of rats of various groups ±s

表3 各组大鼠血清IL-8、TNF-α 水平比较Tab.3 Comparison of serum IL-8 and TNF-α levels of rats of various groups ±s

注：与正常对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与EGCG 低剂量组比较，cP ＜0.05

组别正常对照组模型组EGCG 低剂量组EGCG 高剂量组阳性对照组F 值P 值IL-8（ng∕L）9.47±1.08 14.37±1.36a 13.56±1.45ab 10.19±1.24abc 10.11±1.16abc 46.687＜0.001 TNF-α（ng∕L）4.71±0.67 7.06±0.76a 6.01±0.43ab 5.22±0.49abc 5.15±0.61abc 27.965＜0.001

2.4 血流动力学及右心指数 mPAP、右心指数组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组比较，模型组、EGCG 低剂量组、EGCG 高剂量和阳性对照组mPAP 水平、右心指数升高（P＜0.05）；与模型组比较，EGCG 低剂量组、EGCG 高剂量组和阳性对照组mPAP 水平、右心指数降低（P＜0.05）；与EGCG 低剂量组比较，EGCG 高剂量组和阳性对照组mPAP 水平、右心指数降低（P＜0.05）。EGCG高剂量组与阳性对照组mPAP 水平、右心指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组mCAP 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 各组大鼠血流动力学及右心指数比较Tab.4 Comparison of hemodynamics and right heart index of rats of various groups ±s

表4 各组大鼠血流动力学及右心指数比较Tab.4 Comparison of hemodynamics and right heart index of rats of various groups ±s

注：与正常对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与EGCG 低剂量组比较，cP ＜0.05

组别正常对照组模型组EGCG 低剂量组EGCG 高剂量组阳性对照组F 值P 值mPAP（mmHg）13.86±2.32 25.24±2.79a 21.83±1.95ab 17.76±2.05abc 17.49±2.17abc 38.217＜0.001 mCAP（mmHg）94.78±8.34 90.77±8.76 93.03±9.41 95.28±9.46 92.68±9.96 0.452 0.787右心指数（%）28.29±3.42 40.52±4.87a 36.27±3.75ab 32.42±3.54abc 32.34±3.76abc 17.647＜0.001

3 讨论

肺心病是临床常见病，多发于吸烟者以及老年人群，病程长，并发症较多，易复发。在疾病发展后期，患者心肺功能逐渐衰弱，常伴有呼吸衰竭，患者可出现气喘、紫绀、呼吸困难、血氧饱和度下降等症状，甚至发生休克，严重影响患者生存质量［8］。临床治疗肺心病以保持呼吸通畅、控制感染和改善心肺衰竭为主要原则，多采用抗感染、糖皮质激素类药物改善症状，但由于此类药物持续时间短且存在较大不良反应，患者长期使用易产生药物依赖及抗药性［9］。目前临床上采用的主要降低肺动脉高压的药物包括前列环腺类似物、前列环素受体激动剂、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶-5 抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶受体激活剂。以上药物均会不同程度引起恶心、呕吐、腹泻、头痛、水肿、低血压、肝肾功能损伤等不良反应。目前关于中药方面的研究，只有七叶皂苷钠、丹参酮等多种中药及其有效成分在控制肺动脉高压、改善肺部微循环、治疗肺心病方面具有一定疗效，可为临床治疗肺心病提供一定指导［10-11］。

肺心病引起肺泡组织空气通过性受限，造成呼吸衰竭，呼吸频率减慢，PEF 反映呼吸肌的力量及气道有无阻塞，FEP50 反应气道功能障碍。发生呼吸衰竭时，由于缺氧和CO2潴留，引起酸碱失衡，通过动脉血气分析可以判断呼吸衰竭的呼吸及酸碱失衡情况，PaO2，PaCO2反应呼吸功能，pH 反应酸碱失衡情况［12-13］。肺心病发生过程中TNF-α的产生刺激呼吸道上皮表达IL-8，并可诱导p38 引起EGFR-MAPK-NF-κB-IL8 信号通路的激活，参与炎症反应和应激反应的调控［14-15］。研究表明EGFR∕MAPK 信号通路参与PM2.5 导致的肺毒性损伤及囊性纤维化肺病等肺损伤过程，通过调控EGFR∕MAPK 通路可减轻肺损伤炎症反应，改善肺功能［15］。通过检测平均肺动脉压、平均颈动脉压及右心指数可评估血流动力学及右心室肥厚程度。因此，通过以上指标可客观评价肺心病引起的呼吸衰竭的严重程度。

茶多酚是从茶叶中提取的组成复杂，分子量、性质与化学结构各异的多羟基酚类混合物，其中以儿茶素为主的黄烷醇类化合物是茶多酚的主体部分。儿茶素占茶多酚总量的60% ～80%，包括表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表儿茶素（EC）。其中EGCG 是茶叶中特有的儿茶素，含量最高，约占茶多酚制品的50%左右，它因其结构中有6 个邻位酚羟基而具有优于其他儿茶素的许多特性［16］。研究［17-20］表明EGCG 具有显著的抗氧化、抗炎、抗突变、抗辐射、抗病毒，对心脑血管和神经系统具有良好的保护作用。EGCG 能显著降低血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）含量，降低丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）活性水平，提高高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）的含量，改善大鼠肝脏氧化应激状态［21］。此外，祝田田等［6］研究表明，EGCG 抑制低氧诱导的平滑肌细胞增殖具有浓度依赖性，在100 μmol∕L 浓度时能显著抑制细胞活力，而50 μmol∕L 对细胞活力无显著影响，但50 μmol∕L 能通过时间依赖性抑制低氧诱导的肺平滑肌细胞增殖。以上结果提示EGCG 能抑制低氧引起的肺动脉平滑肌细胞的增殖，从而减少肺心病的发生导致的呼吸衰竭。

本研究采用低氧诱导肺心病大鼠模型，经不同剂量EGCG 药物干预后，EGCG 各剂量组呼吸频率、呼气阻力、PEF 和PEP50 等肺功能相关指标及pH、PaO2和PaCO2等动脉血气指标得到明显改善，炎症因子水平明显下降，同时右心室肥大情况也有一定缓解，且EGCG 高剂量组与阳性对照组改善效果相当。研究结果提示EGCG 可减轻肺心病大鼠炎症反应，改善肺心病引起的机体损伤，减轻呼吸衰竭及不良反应的发生。EGCG 作为茶多酚的主要药理成分，国内外研究大多针对抗氧化应激和抗感染方面［19-22］，尚无针对呼吸衰竭改善方面的研究，是本文的一大创新之处。同时，EGCG的主要作用机制，特别是其细胞信号转导通路及相关靶点，有待进一步研究。

综上所述，EGCG 对低氧条件下引起的肺心病大鼠呼吸衰竭具有显著的抑制作用。本研究可为茶多酚相关产品的开发利用提供了实验依据。