cMyc抑制剂10058-F4诱导白血病THP1细胞凋亡和DNA损伤的机制

魏宇靖 潘婕 柯波 符环 万才水 丁伟荣 程洪波

1江西省人民医院血液内科（南昌330006）；2江西省血液肿瘤细胞生物学重点实验室（南昌330006）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种常见的恶性血液肿瘤，主要表现为骨髓中髓系原始细胞恶性增生，导致骨破坏、骨髓造血衰竭和多个器官组织损伤。AML 好发于老年人，中位发病年龄为68 岁［1］，60 岁以上的老年患者预后较差，只有2.4%的患者能达到诊断后10年的无病存活。AML 复发和耐药仍不可避免，具有高度的异质性，在过去的许多年里，随着新药的问世以及新型治疗策略的发展，AML 的治疗也取得一定的进步。尽管异基因造血干细胞移植认为是至今AML 治愈的唯一途径，但是仍可能出现复发。因此，新的治疗策略和新药的研发仍亟待问世。

原癌基因Myc（cMyc）是一种转录激活因子，其与MAX 转录因子结合形成异二聚体，与E-box DNA 结合区域结合调控靶基因的转录翻译，参与细胞周期、凋亡和细胞转化等细胞进程［2-3］。大约20%的肿瘤与cMyc 的表达相关，其在恶性血液肿瘤的发生发展过程中有着重要的作用［3］。10058-F4 是一种靶向cMyc 蛋白的小分子抑制剂，可以抑制肿瘤细胞增殖并促进细胞凋亡，体外实验证实对多种肿瘤细胞具有增殖抑制及促凋亡作用。有研究结果表示，cMyc 蛋白的上调表达通过调节K562 细胞上的NKG2D 配体的表达，促进逃避NK细胞介导的免疫应答［4］。cMyc 通过结合PD-L1 基因启动子，调控肿瘤细胞中细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）基因的表达，并且两者在食道鳞状细胞癌中的表达水平具有相关性［5］。有文献报道cMyc抑制剂10058-F4 可以通过调控多种信号途径促进白血病细胞凋亡，但仍未完全阐明其作用机制。因此，本研究通过cMyc 抑制剂10058-F4 处理急性单核细胞白血病THP1 细胞，荧光探针染色分析细胞凋亡和线粒体膜电位变化，Western blot 检测与DNA 损伤和细胞凋亡相关蛋白表达，探讨其对细胞凋亡的诱导作用和分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人急性单核细胞白血病THP1 细胞株购于南京凯基公司，cMyc 抑制剂10058-F4 购于上海源叶公司；胎牛血清购于Gibco 公司，RPMI-1640 培养基、青链霉素购于北京索莱宝公司；细胞培养板和培养瓶购于无锡耐思特公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞计数试剂盒购于上海AbMole公司；JC-1 荧光染料购于上海翊圣公司；细胞周期检测试剂盒购于南京凯基公司；Calcein∕PI 检测试剂盒购于上海碧云天公司。兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、Bcl2 相关X 蛋白（BAX）、成熟型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）、磷酸化毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（pATM）和磷酸化组蛋白H2A.X（γH2AX）一抗和羊抗兔标记辣根过氧化物酶（HRP）二抗购于美国abcam 公司。Western 一抗稀释液和封闭液购于上海碧云天公司；超敏ECL 化学发光试剂盒购于上海碧云天公司；倒置荧光显微镜购于德国徕卡公司；酶标仪购于美国赛默飞公司；CO2细胞恒温培养箱购于日本三洋公司；垂直电泳槽和半干转膜仪购于美国BioRad 公司；流式细胞仪购于美国BD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞系及细胞培养 人急性单核细胞白血病THP1 细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液悬浮培养，用新鲜培养液悬浮细胞后铺种于96孔或者12 孔细胞培养板。

1.2.2 细胞生长抑制检测 THP1 细胞用培养液悬浮并计数，将细胞密度调整至1 × 106细胞∕mL，加入终浓度为1、5、10、50、100 μmol∕L 的cMyc 抑制剂10058-F4，对照组加入等体积二甲基亚砜（DMSO），取100 μL 铺种于96 孔板，继续培养12 h和24 h 后每孔加入CCK-8 试剂，孵育2 h 后检测450 nm 处的吸光度（OD450），比较不同浓度cMyc抑制剂10058-F4 对THP1 细胞的抑制率，每组设置3 个复孔。

1.2.3 Calcein/PI 荧光染色分析细胞凋亡 按照上述方法悬浮细胞，分别加入不同浓度的cMyc 抑制剂10058-F4（1、5、10、50、100 μmol∕L），并取2 mL接种于12 孔细胞培养板中，继续培养24 h 后，收集细胞并用PBS 缓冲液清洗，加入Calcein∕PI 检测工作液，37 ℃避光孵育30 min，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.4 细胞周期检测 按照上述方法悬浮并铺种细胞，继续培养24 h 后，收集细胞并用PBS 缓冲液清洗，缓慢加入预冷的70%乙醇后固定细胞24 h，用PBS 缓冲液清洗后按照说明书要求加入RNase（50 μg∕mL），37 ℃水浴30 min，PBS 清洗后400 μL PI（50 μg∕mL），4 ℃避光染色30 min，流式细胞仪上机检测。

1.2.5 JC-1 细胞线粒体膜电位检测 按照上述方法悬浮并铺种细胞，继续培养24 h 后，收集并清洗细胞。并用0.5 mL 新鲜培养基悬浮细胞，加入0.5 mL JC-1 染色工作液，混匀后37 ℃避光孵育20 min，用JC-1 染色缓冲液清洗细胞2 次，用适量缓冲液重悬细胞，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.6 Western blot检测 按照上述方法悬浮并铺种细胞，继续培养24 h 后，收集细胞并加入RAPI细胞裂解液（含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上裂解2 h 后用BCA 法定量样品的蛋白浓度。每孔道取20 μg 的样品上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，于封闭液中室温封闭2 h；4 ℃一抗孵育过夜，PBST 漂洗4 次，每次7 min；用二抗室温孵育2 h，PBST 漂洗4 次；用配置好的化学发光反应液孵育PVDF 膜，化学发光成像系统中显影拍照，用Image J 图像分析软件分析目的蛋白条带与内参条带光密度比值，得出目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 数据采用GraphPad Prism 7 软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，两组间的差异比较采用非配对t检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 cMyc抑制剂10058-F4抑制THP1细胞增殖 采用CCK-8 方法对THP1 细胞增殖进行检测，检测结果显示不同浓度cMyc 抑制剂10058-F4（1、5、10、50、100 μmol∕L）处理THP1 细胞12 h 和24 h 后，均对THP1 细胞增殖产生明显的抑制作用，该抑制作用随着cMyc 抑制剂10058-F4 浓度增加抑制效应也随之增强，cMyc 抑制剂10058-F4 处理THP1 细胞24 h 后的抑制作用明显高于12 h 组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 cMyc 抑制剂10058-F4 不同浓度和作用时间对THP1细胞生长抑制率的影响Fig.1 The effects of cMyc inhibitor 10058-F4 with different concentrations and time on growth inhibition rate of THP1 cells

2.2 cMyc抑制剂10058-F4诱导THP1细胞凋亡 Calcein∕PI 荧光染色结果显示，cMyc 抑制剂10058-F4 处理处理后，PI 阳性细胞随着药物浓度的增高而增加。Calcein 染色代表细胞活力，染色结果显示低浓度（1 μmol∕L 和5 μmol∕L）组中Calcein 荧光强度与对照组差异无统计学意义，高浓度组（10、50、100 μmol∕L）中Calcein 荧光强度明显减弱低。结果提示cMyc 抑制剂10058-F4 可降低细胞活力，诱导THP1 细胞的凋亡，见图2。

图2 cMyc 抑制剂10058-F4 诱导THP1 细胞凋亡Fig.2 The cMyc inhibitor 10058-F4 induces apoptosis of THP1 cells

2.3 cMyc 抑制剂10058-F4 诱导THP1 细胞中线粒体膜电位下降 THP1 细胞经不同浓度cMyc 抑制剂10058-F4 处理24 h 后，经过线粒体膜电位荧光探针（JC-1）的加载，通过荧光显微镜观察荧光的变化，反映细胞线粒体膜电位的变化，结果显示不同浓度的cMyc 抑制剂10058-F4 处理THP1 细胞后红素荧光逐渐减弱，绿色荧光增强，平均荧光强度（MFI）比值逐渐降低，提示线粒体膜电位出现下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。结果表明cMyc 抑制剂10058-F4 诱导THP1 细胞凋亡可能是通过降低线粒体膜电位所介导。

图3 cMyc 抑制剂10058-F4 诱导THP1 细胞线粒体膜电位下降Fig.3 The cMyc inhibitor 10058-F4 induced a decrease in mitochondrial membrane potential in THP1 cells

2.4 cMyc 抑制 剂10058-F4 诱导THP1 细胞G2/M细胞周期阻滞 THP1 细胞经不同浓度cMyc 抑制剂10058-F4 处理24 h 后，流式细胞仪分析细胞周期。结果显示不同浓度的cMyc 抑制剂10058-F4处理THP1 细胞后，S 期细胞比例均明显高于对照组，G1 期细胞细胞比例低于对照组，G2∕M 期细胞比例随着药物浓度逐渐上升，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），提示10058-F4对THP1 细胞可能具有DNA 损伤诱导作用，见图4。

2.5 cMyc 抑制剂F410058 诱导THP1 细胞凋亡和DNA 损伤相关蛋白的表达 THP1 细胞经cMyc 抑制剂10058-F4 处理24 h 后，Western blot 检测细胞中相关蛋白表达水平。结果显示不同浓度的cMyc抑制剂10058-F4 处理后，促凋亡蛋白Bax 和Cleaved-Caspase-3 的表达水平明显高于对照组，参与DNA损伤应答蛋白γH2AX 和pATM 的表达水平也明显高于对照组，并随着药物浓度逐渐上调，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），如图5。结果提示cMyc 抑制剂10058-F4 可能诱导THP1 细胞DNA 损伤，激活P53 相关信号途径促进细胞凋亡。

图5 cMyc 抑制剂10058-F4 对THP1 细胞凋亡和DNA 损伤相关蛋白表达的影响Fig.5 Effects of the cMyc inhibitor 10058-F4 on the protein expression associated with apoptosis and DNA damage in THP1 cells

3 讨论

AML 是一种目前尚未能治愈的恶性血液肿瘤，AML 的显著特征为疾病的克隆性进展。虽然化疗和造血干细胞移植为代表的治疗策略能提高缓解率，但仍会出现复发以及药物耐受，特别是老年患者由于存在基础疾病，治疗反应性差，需要进行个体化治疗［6］。cMyc 作为原癌基因，在多种肿瘤和血液肿瘤中高表达或者存在突变，其作为转录因子与Max 形成异二聚体，并与靶基因启动子区的特异的E-box DNA 序列结合［7］。小分子化合物可以通过抑制cMyc-MAX 复合物的形成，降低cMyc 的转录活性并导致其靶基因表达受阻，从而影响细胞周期和细胞凋亡［8］。Myc 可以促进壁龛中的造血干细胞进入增殖祖细胞状态，cMyc 蛋白的表达将介导细胞周期快速进入G1 期，其后表达下调，从而参与细胞周期调控［9］。cMyc 受核因子κB（NF-κB）信号途径调控，IκB 激酶（IKK）复合物中IKKα 和IKKβ 与cMyc 结合，并通过催化其S67 和S71 磷酸化位点增强其稳定性，转录翻译抗凋亡蛋白发挥其抗凋亡作用［10］。cMyc 作为Flt3-ITD 信号的下游靶标，Flt3-ITD 通过Wnt 信号途径调控cMyc，而且Flt3-ITD 还可以抑制Myc 拮抗物Mxi-1 从而增强Myc 活性，高三尖杉酯碱联合奎扎替尼可以通过抑制FLT3-AKT-cMyc 信号途径增强FLT3-ITD 急性髓系白血病细胞体外治疗效果［11-12］。多肽类抑制剂OmoMYC 可以抑制三种MYC 蛋白与启动子的结合能力，发挥抗肿瘤作用明显且副作用少，并且以及进入临床试验阶段。APTO-253 抑制剂通过抑制MYC 基因的表达水平，用于复发∕难治性AML 和骨髓异常综合征的治疗，也进入了I 期临床试验阶段［13-14］。

THP1 细胞来源于急性单核细胞白血病患者，其属于AML 中一种亚型，携带CSNK2A1-DDX39B融合基因［15］。本研究应用CCK-8 和细胞凋亡实验，分析cMyc 抑制剂10058-F4 对THP1 细胞的生长抑制及细胞凋亡的诱导作用。实验结果显示，1 ～100 μmol∕L 浓度的cMyc 抑制剂F410058 呈浓度依赖性地抑制THP1 细胞增殖；荧光探针染色实验结果显示1 ～100 μmol∕L 的cMyc 抑制剂10058-F4处理组细胞中Calcein 荧光强度逐渐降低，活性细胞数也明显降低，PI 阳性细胞数比例明显高于对照组，提示cMyc 抑制剂10058-F4 对THP1 细胞具有明显的细胞毒性和细胞凋亡诱导作用。cMyc 抑制剂10058-F4 可以诱导细胞凋亡，但是其作用机制仍未阐明，本研究通过JC-1 荧光探针加载细胞，荧光显微镜分析THP1 细胞线粒体膜电位水平变化，实验结果显示cMyc 抑制剂10058-F4 处理后红色荧光逐渐减弱，绿色荧光逐渐增强，提示线粒体膜电位随着药物浓度增加而逐渐下降。cMyc 抑制剂10058-F4 可以诱导卵巢癌细胞中FOXO 家族基因mRNA 水平的表达，从而上调下游与细胞凋亡相关蛋白的表达，例如PUMA，Bim，和FasL 等［16］。本研究的Western blot 实验结果也显示BAX 的表达水平随着药物浓度的增加而增强，并且细胞凋亡执行蛋白Cleaved-Caspase3 的表达水平也是表达逐渐增强。

经10058-F4 处理后的THP1 细胞经过流式细胞仪分析细胞周期，结果显示处理后出现G2 期细胞比例随着药物浓度逐渐升高，提示10058-F4 可诱导THP1 细胞的G2∕M 细胞周期阻滞，并可能具有DNA 损伤诱导作用。也有研究［17］表明，下调骨肉瘤细胞cMyc 的表达可以抑制细胞增殖，并通过cMyc∕p21∕CDC2 信 号 途 径 诱 导G2∕M 细 胞 周 期阻滞，增强细胞对化疗的敏感性。还有研究显示CircECE1 与cMyc 相互作用以抑制E3 泛素连接酶斑点型锌指结构蛋白（speckle-type POZ）介导的cMyc 泛素化和降解，从而抑制硫氧还蛋白结合蛋白（TXNIP）转录，并激活Warburg 效应，参与糖代谢调节［18］。本研究通过Western blot 实验分析发现10058-F4 处理可以上调ATM 和H2AX 蛋白磷酸化水平，提示10058-F4 可诱导DNA 损伤和相关蛋白的活化。有研究［19］指出，cMyc 过表达将促进S 期时象细胞启动DNA 复制过程，并加剧DNA 基因组的不稳定性，促进H2AX 的磷酸化水平，可能导致肿瘤的发生。Myc 可以通过产生活性氧簇以及异常的DNA 复制诱导DNA 损伤，联合抑制PI3K 相关的DNA 损伤应答激酶和mTORC1 可诱导Myc 驱动的B 细胞淋巴瘤细胞凋亡［20］。但是至今未见到关于10058-F4 诱导DNA 损伤应答及作用机制的文献报道。

综上所述，cMyc 抑制剂F410058 对单核细胞白血病THP1 细胞的增殖具有抑制作用，并诱导细胞凋亡，可能是通过诱导线粒体凋亡途径所介导。同时，cMyc 抑制剂F410058 还具有诱导DNA损伤的作用，也是其诱导细胞凋亡的主要机制之一。cMyc 抑制剂F410058 的抗白血病作用机制的研究为AML 的临床治疗提供理论基础，可能成为AML 患者潜在的治疗选择。