呼吸道合胞病毒通过TRAF6/NF⁃κB通路调控人T淋巴细胞白血病细胞增殖

聂钰君 侯燕 钱丹

湖北文理学院附属医院襄阳市中心医院（湖北襄阳 441021）

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leu⁃kemia，ALL）是儿童发病率第一位的恶性肿瘤，占儿童白血病的70%，部分具有遗传倾向［1-2］，多采用化疗，5年无病生存率已达80%以上，但有少部分患儿难治或复发甚至死亡［3］，因此迫切需要探究新的疗法提高ALL 的临床疗效。现有多种治疗癌症的新方法，如多药联合化疗、靶向治疗、生物治疗等［4］，其中，溶瘤病毒治疗是近年来发展的新的生物疗法。溶瘤病毒是基因工程病毒或天然存在的病毒，可以选择性复制并杀死癌细胞而不损害正常组织［5］，这为肿瘤恶性细胞的特异性和靶向选择治疗提供了可能［6］。据报道，麻疹病毒对儿童B 系ALL 疗效显著［7］，新城疫病毒可抑制ALL 细胞的增殖［8］，呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）与他们同属副粘病毒家族，但RSV 在白血病鲜有报道。因此，本研究采用MTT、FCM、RT⁃PCR、Western blot 等方法评估感染RSV后Jurkat 细胞的增殖及凋亡情况，以探究其可能的溶瘤作用。

1 材料与方法

1.1 材料RSV⁃A2 株及Jurkat 细胞来源于ATCC，MTT 购自美国MedChem Express，TRIzol 来自科瑞生物制品有限公司，M⁃MLV 逆转录试剂盒、实时定量PCR 试剂盒、引物购自上海Invitrogen，Taq DNA聚合酶购自Fermentas，细胞蛋白裂解液、BCA 蛋白检测试剂盒及ECL 化学发光试剂盒均购自碧云天生物公司，cleaved⁃Caspase⁃8 单抗购自上海MACK⁃LIN，其余抗体均购自上海Abcam。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养Jurkat 细胞采用含双抗（青霉素100 U/mL、链霉素0.1 mg/mL）及10%胎牛血清RP⁃MI⁃1640 培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，实验用细胞均处于对数生长期。

1.2.2 病毒感染细胞在12 孔板中接种Jurkat 细胞，待汇合度达60%时每孔加入1×107PFU/mL 病毒液60 μL（MOI 3），吸附1 h 后再加入含10%胎牛血清的RPMI⁃1640 培养液900 μL，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，分别于RSV 感染后3、6、12、24 h收集细胞，通过qRT⁃PCR 检测RSV⁃NS2 mRNA 的表达来确认RSV 是否感染Jurkat 细胞。

1.2.3 MTT 实验收集Jurkat 细胞并调浓度为5×105/mL，取96 孔板，每孔接种细胞180 μL，置37 ℃、5%CO2培养箱培养12 h。每孔加入RSV 1×107PFU/mL 病毒液10 μL（MOI 3），设未感染的细胞作为空白对照。培养不同时间后，每孔加入20 μL（浓度为5 g/L）MTT，继续培养4 h。每孔加入100 μL DMSO，振荡混匀后培养20 h。在酶联免疫检测仪上读取波长为570 nm处的吸光度值（A值）。实验组细胞的相对增殖水平=A（实验孔）/A（阴性对照），实验重复3 次。

1.2.4 克隆形成实验RSV 感染Jurkat 细胞后，将细胞以200 个/孔密度接种于6 孔板中，置于37 ℃，5%CO2培养箱内培养12 d，用PBS 小心洗涤细胞3 次，甲醇固定20 min，Giemsa 染液染色20 min，流水缓慢洗去染色液。镜下计数大于50 个细胞的克隆数。

1.2.5 FCM 检测凋亡细胞接种于24 孔板，RSV作用Jurkat 细胞12、24、48 h 后，收集2×105细胞经PBS 洗涤后用Annexin 2V 2FITC（215 μg/mL）和PI（10 μg/mL）染色，避光作用10 min 后，在流式细胞仪上检测凋亡细胞，实验均设3 复孔。

1.2.6 Western blot 实验采用细胞蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，10%SDS⁃PAGE 凝胶电泳，至marker 出现清晰条带停止电泳。200 mA 转3 h 至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温摇床封闭2 h，一抗cleaved⁃Caspase⁃3（1∶500）、cleaved⁃Caspase⁃8（1∶1 000）、cleaved⁃Caspase⁃9（1∶1 000）、Bcl2（1∶1 000）、TRAF6（1∶2 000）、p⁃NF⁃κB（1∶2 000）、NF⁃κB（1∶2 000）及GAPDH（1∶2 500）4 ℃孵育过夜，羊抗兔二抗（1∶2 500）室温摇床孵育90 min，TBST 洗膜后采用ECL 化学发光法压片、显影、定影。胶片采用GDS⁃8000 型凝胶成像系统进行灰度扫描，以目的条带与GAPDH 灰度比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.2.7 qRT⁃PCR 实验25 μL 的PCR 反应体系含有2 μL 逆转录反应产物、10 μmol/L 特异引物各1 μL 以及0.5 μL TaqDNA 聚合酶，反应在DNA 扩增仪上进行：95 ℃变性2 min，扩增条件为95 ℃30 s，退火温度72 ℃1 min，循环35 次。用GAPDH作为RSV⁃NS2 和TRAF6 的内部参照，目的基因的相对表达量以与GAPDH 的比值计算，实验重复3 次。目的基因的引物序列见表1。

表1 qRT⁃PCR 目的基因的引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT⁃PCR target gene

1.3 统计学方法应用GraphPad Prism 8 软件进行数据分析。实验结果以均数±标准差表示。多因素比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSV 感染Jurkat 细胞将RSV 感染对数生长期Jurkat 细胞，感染3、6、12、24 h 后收集细胞，采用qRT⁃PCR 检测RSV 是否感染Jurkat 细胞。结果显示，Jurkat 细胞内RSV⁃NS2 表达随时间延长而增强，6 h表达差异有统计学意义（P<0.001）。

2.2 RSV抑制Jurkat细胞增殖RSV感染Jurkat细胞3、6、12、24 h 后收集细胞，采用MTT 检测Jurkat细胞增殖，结果显示Jurkat 细胞的增殖能力从6 h后显著下降，呈时间依赖性（P<0.05，图1A）。RSV 感染Jurkat 细胞后12 d，克隆形成实验显示Jurkat 细胞的克隆数明显减少（P<0.05，图1B）。

图1 RSV 抑制Jurkat 细胞的增殖Fig.1 RSV inhibited the proliferation of Jurkat cells

2.3 RSV 促进Jurkat 细胞凋亡将RSV 感染对数生长期Jurkat 细胞，12、24、48 h 后收集细胞，流式细胞术结果显示RSV 感染后，Jurkat 细胞的凋亡水平逐渐上升，有时间依赖性（P<0.05，图3A）。Western blot 结果显示，cleaved Caspase⁃3 和cleaved Caspase⁃9 的表达均显著增加，Bcl2 的表达明显减少，呈时间依赖性（P<0.05，图3B），cleaved Cas⁃pase⁃8 的表达无明显改变。

图2 RSV 促进Jurkat 细胞的凋亡Fig.2 RSV promoted the apoptosis of Jurkat cells

2.4 RSV 抑制TRAF6/NF⁃κB 通路活化RSV 感染Jurkat 细胞12、24、48 h 后收集细胞，qRT⁃PCR 结果显示RSV 显著抑制了TRAF6 的表达，有时间依赖性（P<0.001）。Western blot 的实验结果显示，TRAF6 和p⁃NF⁃κB 的表达随感染时间的延长而降低（图3）。

图3 RSV 抑制TRAF6/NF⁃κB 通路的活化Fig.3 RSV inhibited the activation of TRAF6/NF⁃κB pathway

3 讨论

ALL 作为儿童时期最常见的恶性血液病［9］，5年无病生存率已达80%以上，但仍有少部分患儿复发。溶瘤病毒是近年来研究较多的生物疗法，已有报道证实麻疹病毒、新城疫病毒均对白血病细胞有抑制作用，但RSV对白血病细胞的作用尚未明确。国内外研究发现，RSV 可诱导前列腺癌细胞［10］、肝癌细胞［11］、皮肤癌细胞［12］、肺癌细胞［13］凋亡，提示RSV 可诱导多种肿瘤细胞凋亡，但关于RSV 是否诱导白血病细胞凋亡鲜有报道，其机制尚未明确。本研究选择Jurkat 细胞［14］为研究对象，探索RSV 对Jurkat 细胞的作用及可能的分子机制。

研究显示RSV 编码的非结构蛋白NS2 参与RSV 作用的过程［15］，因此，本研究采用qRT⁃PCR 检测RSV⁃NS2 mRNA 的表达来确认RSV 是否感染Jurkat 细胞。研究结果显示，Jurkat 细胞在感染后3 h 内RSV⁃NS2 表达开始出现，6 h 明显增高，随时间延长，RSV⁃NS2 RNA 在Jurkat 细胞中的表达逐渐增多，提示RSV 可感染Jurkat 细胞。

众所周知，细胞增殖［16］和细胞凋亡［17］是评价细胞生长的重要指标，因此，本研究采用以下方法评估RSV 对Jurkat 细胞的作用。本实验MTT 及克隆形成实验结果显示Jurkat 细胞的增殖能力下降，克隆数明显减少，提示RSV 抑制了Jurkat 细胞增殖。FCM 结果显示RSV 感染后Jurkat 细胞的凋亡率呈时间依赖性上升，说明RSV 感染Jurkat 细胞后细胞凋亡增加。Western blot 的结果提示RSV 大部分通过Caspase⁃3、9 和Bcl2 通路诱导Jurkat 细胞凋亡。

肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）是肿瘤坏死因子超家族和Toll 样受体超家族的重要结合蛋白［18］。另一方面，NF⁃κB 转录因子是免疫应答和应激反应以及细胞生长的关键调节因子，可通过与其他通路协调作用来影响细胞的增殖［19］。TRAF6 的激活启动下游信号传导，导致NF⁃κB 亚单位从细胞质转移到细胞核，促进相关基因表达，对细胞增殖和免疫应答起正反馈调节［20］。抑制TRAF6 泛素连接酶活性，对NF⁃κB 激活和自噬功能的TLR4 信号进行负性调节，如杀菌活性、癌细胞迁移及侵袭［21］。有研究显示TRAF6 通过激活TRAF6⁃NF⁃κB/AP⁃1 信号通路，促进大肠癌细胞的增殖和转移［22］。TLR3 或TLR4 激活诱导的自噬通过促进TRAF6 泛素化增强各种细胞因子的产生，从而促进肺癌细胞的迁移和侵袭［23-26］。本研究发现RSV 感染Jurkat 细胞12 h 以后，TRAF6 和p⁃NF⁃κB 的表达随感染时间的延长而减弱，说明RSV 感染抑制了TRAF6/NF⁃κB的表达，因此，笔者推断RSV 通过TRAF6/NF⁃κB 通路抑制Jurkat 细胞的增殖。然而，RSV 影响Jurkat细胞的其他机制还有待进一步的探究。

综上所述，本研究发现RSV感染对Jurkat细胞具有抑制作用，这种作用可能通过抑制TRAF6/NF⁃κB 信号通路的活化实现的。如能在动物实验中加以验证，探明RSV 致瘤体细胞凋亡机制，将为白血病的溶瘤治疗提供理论基础。