基于网络药理学的鬼针草治疗干眼的机制研究

乔令瑜，程娟

干眼（dry eye）是眼科常见疾病，以眼部干涩、异物感、畏光等为主要表现。目前，国内干眼发病率达到21%～30%[1]。按发病因素，干眼可分为全身因素性、局部因素性、环境因素性等[2]。西医治疗主要有泪液替代、抗炎等，而腺体移植术则适用于重度干眼，但有产生并发症（腺体坏死、积液等）的可能[3]。因此，寻找可针对性治疗干眼的药物成为研究热门。

中医学上干眼属于“白涩症”范畴，治疗有中药、针灸、离子导入等方法，因疗效确切、副作用小而受到广泛应用。鬼针草首载于《本草拾遗》[4]，可降血压，抑菌抗炎[5]。上世纪90 年代有学者发现鬼针草可致人流泪，研究证实鬼针草口服及其提取液滴眼对干眼有效[6-7]。现代药理学认为鬼针草具有类雄激素作用，对雄激素缺乏型及泪液分泌不足型干眼均具有良好效果[8-9]。

网络药理学囊括生物信息学、药理学、生物学网络等，可对药物及疾病靶点进行整体预测，将两者的相互作用关系可视化并进行阐释。本研究采用网络药理学方法，揭示鬼针草治疗干眼的作用机制。

1 资料与方法

1.1 鬼针草活性成分与作用靶点的筛选与收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP，在“Herb name”词条框中输入“鬼针草”，获取分子信息，以“口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%”“药物相似性（drug likeness，DL）≥0.18”作为筛选条件获取鬼针草的活性化学成分。并使用Uniprot对活性成分作用的靶蛋白名，以“organism：homo sapiens”和“reviewed：yes”为筛选条件将靶蛋白名转换为基因名称。

1.2 干眼潜在靶点预测及关键基因获取

通过OMIM、DrugBank、TTD、Genecards 数据库，其中Genecards 数据库筛选条件为相关性分数（Relevance score）≥1.855。以“dry eye”为关键词检索干眼相关基因，删除重复值后对数据进行整理合并。通过Venny 工具将鬼针草相关靶点与干眼相关靶点取交集并绘制Venny 图，交集基因为关键基因。

1.3 关键基因蛋白互作网络构建及核心基因获取

将关键基因导入STRING 在线数据库，限定物种为“Homo sapiens”，构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，以可靠性阈值＞0.4 作为截断值，将数据下载后导出为“TSV”及“png”格式。随后“TSV”格式数据导入Cytoscape 可视化分析软件进行可视化，去除游离节点，使用CentiScape 中“度中心性”算法计算degree 值评估网络中基因节点的重要性，筛选PPI 网络核心靶点，选取degree 值前10 位的基因作为核心基因并进行可视化。

1.4 关键基因富集分析

基因本体学（gene ontology，GO）可对高通量基因组或转录组数据中的基因开展生物学进程（biological processes，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）分析，Kyoto基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）对基因进行功能分析及预测。使用R 语言中clusterProfiler 包对关键基因进GO和KEGG 分析和可视化，其中GO 分析的筛选条件为P＜0.01，Q＜0.05；KEGG 分析的筛选条件为P＜0.05。

1.5 鬼针草-干眼-通路网络的构建

根据GO 功能富集分析结果，预测治疗干眼的主要靶点，并使用Cytoscape3.7.2 软件构建“鬼针草-干眼-通路”网络图，根据网络拓扑学参数判断核心靶点发挥药效的主要活性成分。

2 结果

2.1 鬼针草活性成分

通过TCMSP 检索到47 个鬼针草化合物，筛选出6 个活性化合物。将鬼针草对应靶点进行基因注释，删除重复值，得到218 个靶点（表1）。

表1 鬼针草活性化合物基本信息

2.2 干眼相关靶点及关键基因获取

从OMIM、DrugBank、TTD、Genecards 数据库中分别获取到160、27、3、1,145 条疾病相关靶点，取并去重后得到1,313 条干眼相关基因靶点信息。将鬼针草相关靶点与干眼相关靶点取交集共得到123 个交集基因为鬼针草治疗干眼的关键基因（图1）。

图1 鬼针草和干眼相关靶点匹配

2.3 关键基因蛋白互作网络构建及核心基因获取

PPI 网络构建共得到123 个蛋白，2,228 条相互关系，平均点度36.2（图2A），依据Degree 算法得到排名前10 的核心基因为：AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、EGF、EGFR、PTGS2（图2B）。

图2 鬼针草与干眼蛋白互作网络与核心基因。2A 鬼针草治疗干眼关键基因蛋白互作网络；2B 鬼针草治疗干眼核心基因

2.4 关键基因富集分析

关键基因GO 富集共870 条，其中BP 787 条，CC 25 条，MF 57 条，主要与调控细胞炎症因子、细胞凋亡、免疫反应、衰老等有关（图3）；KEGG 通路共富集241 条，主要与Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）信号通路，核转录因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路等有关（图4）。

图3 鬼针草与干眼GO 富集分析。红色代表生物过程，绿色代表细胞成分，蓝色代表分子功能

图4 鬼针草与干眼KEGG 富集分析。条形图颜色表示校正后P 值大小

2.5 鬼针草-干眼-通路网络的构建

应用Cytoscape3.7.2 构建鬼针草-干眼-靶点-通路网络，使用内置Network Analyzer 程序对鬼针草治疗干眼网络进行拓扑分析，获得鬼针草核心成分及作用靶点（图5）。

图5 鬼针草-干眼-通路网络。青色为生物学进程，黄色为鬼针草成分，红色为疾病，蓝色为靶点名称

3 讨论

2020 年中国干眼专家共识[2]认为，干眼为多因素引起的眼表疾病，眼表微环境紊乱是其主要的病理生理学改变，而眼表微环境由多种因素共同参与维持平衡，炎症、免疫等原因均可造成眼表微环境紊乱，导致干眼发生。随着相关炎症机制研究不断深入，干眼的抗炎治疗亦成为研究热点。

本研究通过对鬼针草活性成分的作用靶点及干眼相关靶点取交集，筛选出鬼针草治疗干眼的活性成分-靶点-疾病网络，对核心靶点进行生物过程和信号通路分析。研究表明，鬼针草治疗干眼的关键成分为黄酮类化合物、檞皮素、木犀草素等。STRING 蛋白互作网络分析提示，核心基因包括表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等。黄鹤龄等[10]研究显示，TNF-α、IL-6 在蒸发过强型干眼中特异性升高，认为TNF-α、IL-6 可作为干眼诊断和疗效指标。崔红等[11]研究发现，IL-1β、TNF-α 及VEGF 等炎症因子浓度均高于正常对照组，认为TNF-α 等炎症因子可促使VEGF 表达上调，其作用机制可能是炎症因子激活眼表炎症反应并持续对眼表产生损害。另外，EGF 可促进结膜杯状细胞增殖和分化，同时也是泪液中免疫成分之一[12]。GO 功能富集分析显示，鬼针草主要通过调控细胞炎症因子、细胞凋亡、免疫反应等生物学过程治疗干眼。KEGG 通路富集分析提示，靶点多富集于TLRs 信号通路，NF-κB 信号通路、MAPK 信号通路。TLRs 存在于所有生物体的大多数细胞内，是一类新型模式识别受体，在免疫反应中起重要作用[13]。目前，已有研究证实TLR2、TLR4、TLR9 等在干眼患者外周血中的表达显著增加[14-15]，其表达量同干眼角膜炎症程度呈正相关[16-17]。由此可见，TLR 信号通路参与了干眼的发生发展，其激活水平与炎症因子、TNF-α 水平及泪液渗透压升高等均具有密切联系。NF-κB 存在于真核细胞内，与细胞内的信息传递并导致相关因子表达有关，在信号转导、免疫、炎症和细胞凋亡等方面具有独特作用，多种因素如白细胞介素-1（interleukin-6，IL-1）、TNF-α 等可以激活NF-κB 启动免疫反应和细胞分化等过程[18]。研究显示[19]，角膜上皮细胞中NF-κB 通路可由高渗泪液激活，导致炎性因子在眼表高表达。MAPK 信号通路是广泛存在并高度保守的信号转导途径，在调控基因转录、蛋白表达、细胞周期、凋亡等生物学反应中发挥作用[20]。LUO 等[21]的一项动物实验显示，小鼠干眼可激活MAPK 信号通路，并刺激眼表炎性因子产生，提示MAPK 信号通路在干眼发生发展中具有重要作用。结合KEGG 通路富集分析，本研究认为鬼针草可能通过TLR 信号通路、NF-κB 信号通路、MAPK 信号通路减轻眼表炎症反应，有助于改善干眼。然而，KEGG 通路富集分析结果除TLR 信号通路、NF-κB 信号通路、MAPK 信号通路外，尚有白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信号通路等，提示鬼针草可能通过多种机制对干眼的眼表微环境进行调控。

本研究采用网络药理学方法对鬼针草治疗干眼作用机制进行研究，结果表明，鬼针草可通过对EGF、TNF、VEGFA、IL-6 等基因的影响，以及对TLR、NF-κB、MAPK 信号通路的调控，达到减轻干眼患者眼表炎症反应，改善干眼主观症状及临床指标的效果。本研究可为干眼的药物选择及治疗方案提供新思路。