三七配伍生蒲黄治疗糖尿病视网膜病变的网络药理学分析

于坷鑫，邓夏烨，孙河，董霏雪，张雪松，薛晓蕊

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，已是全球范围内排名前4 位的致盲性眼病[1]。DR 的基本病理改变包括视网膜血管周细胞丢失、基底膜增厚、微血管瘤形成、内皮细胞增殖和新生血管形成[2]。慢性高血糖诱导的慢性炎症、氧化应激、糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）、细胞因子、脂质氧化及其代谢物、血流动力学异常等多种机制的激活是DR 病理改变的核心驱动力[3-5]。中医学认为DR 是消渴病变病，可归属于“消渴目病”等范畴，因久病伤阴，燥热愈盛，内寒更著，致目络瘀阻。孙河等[6-12]多年来致力于防治DR 的研究，建议治疗DR应遵循止血不留瘀，化瘀不伤正的治疗原则。三七性温，入肝经血分，和营止血，通脉行瘀而复敛新血；蒲黄性平，入肝、心包经，《本草汇言》曰：“……血之上者可清，血之下者可利，血之滞者可行，血之行者可止；凡生用则性凉，行血而兼消……”；二者配伍有化瘀止血通络之功效。本研究利用网络药理学、药物靶向性互动资料库及生物分析方法，初步探讨和分析三七配伍生蒲黄防治DR 的潜在作用机制。

1 资料与方法

1.1 三七-生蒲黄主要化合物及作用靶点的获取

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索“三七”，选择Panax Notoginseng；“蒲黄”，选择Pollen Typhae（由于数据库中并未对蒲黄的炮制方法进行区分，本研究认为蒲黄的化合物成分与生蒲黄相同）。为获取更全面的信息，未对筛选条件设置任何限制，将三七与生蒲黄的全部化合物纳入数据库中。利用Uniprot 数据库的UniprotKB 检索功能，对全部生物活性成分进行“Homo sapiens”人类基因简称的查询和筛选，获得三七和生蒲黄的可能作用靶点。

1.2 DR 靶点的获取

从Genecards 数据库、OMIM 数据库、DisGeNET数据库、DrugBank 数据库4 个疾病相关靶点的常用数据库中检索关键词“diabetic retinopathy”“retinopathy，diabetic”，收集并整理出DR 相关靶点数据库。

1.3 三七-生蒲黄治疗DR 潜在靶点的预测

借助Venny 2.1.0 工具，将药物与疾病的靶点取交集，预测出三七-生蒲黄治疗DR 的潜在靶点，并绘制Venny 图。同时，利用Cytoscape3.7.2 构建成分-靶点-疾病网络图。

1.4 PPI 网络的构建及其网络拓扑分析

将预测出的三七-生蒲黄治疗DR 的潜在靶点导入String 数据库，设物种为“Homo sapiens”，阈值为“medium confidence=0.4”，其余参数为默认，得到的结果以TSV 文件形式保存。在Cytoscape3.7.2 软件中导入TSV 文件，使用“Tools”工具下的“Network Analysis”功能进行网络拓扑学分析，再用CytoHubba 插件对其进行处理，并绘制蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络图。根据拓扑 学Degree 值大小，找出三七-生蒲黄治疗DR 的核心基因。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

本研究利用Bioconductor 生物信息软件包，借助R 软件编程方式（R x64 3.6.2），将基因名称转化为基因ID，并以P≤0.05 为设定，进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和Kyoto 基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，对排名前20 的条目进行制图，找到核心通路，进一步说明核心靶点和关键信号通路在三七-生蒲黄治疗DR 中的作用。

2 结果

2.1 三七-生蒲黄主要化合物及作用靶点的获取结果

三七-生蒲黄在TCMSP 数据库中共有148 个化合物，对应的作用靶点330 个（文章仅列举部分活性成分及靶点）（表1、2）。根据成分-靶点网络拓扑学分析，Degree 排名前10 位的成分如表所示（表3）。

表1 三七-生蒲黄药物活性成分信息表

表2 三七-蒲黄有效化合物作用靶点（部分）

表3 排名前10 位的活性成分

2.2 疾病靶点获取结果

根据筛选条件，Genecards 数据库得到3,497 个疾病靶点，DrugBank 数据库得到4 个靶点，Dis-GeNET 数据库得到246 个靶点，OMIM 数据库得到229 个靶点，去除重复靶点后，获取DR 疾病靶点为3,680 个。根据相关度本文列出前100 个（表4）。

表4 预测疾病作用靶点

2.3 三七-生蒲黄治疗DR 潜在靶点的预测结果

借助Venny 2.1.0 工具将药物靶点与疾病靶点取交集，得到交集靶点159 个，并导出Venny 图（图1）。再利用Cytoscape3.7.2 构建药物-成分-靶点-疾病网络图（图2）。

图1 三七-生蒲黄与糖尿病视网膜病变交集靶点Venny 图

图2 三七-生蒲黄药对的活性成分-作用靶点-疾病网络图

2.4 PPI 网络的构建及网络拓扑学分析结果

将三七-生蒲黄治疗DR 的交集靶点录入String 数据库获取蛋白质相互作用关系，得到的结果导入Cytoscape3.7.2 软件中绘图（图3）。PPI 网络中包含个159 节点，1,828 条边，平均度值为23。根据网络拓扑学分析，将拓扑学指标Degree 值降序排列，筛选出前30 位的靶点为：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，胰岛素，过氧化氢酶，白细胞介素-6，2,4-二烯酰辅酶A 还原酶1，血管内皮生长因子A，促分裂原活化蛋白激酶3，表皮生长因子，白细胞介素-1β，趋化因子(C-C 基元)配体2，v-jun 肉瘤病毒17癌基因同源物，促分裂原活化蛋白激酶1，促分裂原活化蛋白激酶8，前列腺素内过氧化物合成酶2等30 个基因（图4）。表明这些基因在网络中具有重要地位，可以作为三七配伍生蒲黄有效成分的靶点基因。

图3 三七-生蒲黄药对治疗糖尿病视网膜病变的蛋白互作网络

图4 三七-生蒲黄药对治疗糖尿病视网膜病变蛋白互作网络邻接节点数目条形图

2.5 GO 富集分析结果

GO 富集分析功能，经过P＜0.05 的筛选后选择了排名前20 个GO 富集点，并绘制气泡图。气泡越大说明富集目标越多，相关度越强。其中生物学过程，细胞组成，分子功能主要涉及辅酶结合、电子转移活性、维生素结合、丝氨酸水解酶活性、裂解酶活性、四吡咯结合、丝氨酸型内肽酶活性、氧化还原酶活性作用于供体CH-OH 基团的影响、血红素结合等（图5）。

图5 三七-生蒲黄有效作用靶点GO 富集分析气泡图

2.6 KEGG 通路分析结果

KEGG 通路富集分析结果如图所示，根据P 值筛选出前20 条，三七-生蒲黄药对的关键基因靶点主要富集的通路为阿尔茨海默病、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、非酒精性脂肪性肝病、低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信号通路、美洲锥虫病、肿瘤坏死因子信号通路、松弛信号通路、逆行内源性大麻素信号通路等（图6）。

图6 三七-生蒲黄有效作用靶点KEGG 通路富集分析气泡图

3 讨论

中医学遵循“辨证论治”原则，施予理法方药配伍，以“多成分-多靶点-多途径”方式防治疾病的发生发展[13-14]。三七与生蒲黄共为临床经验方“达明饮”的君药，孙河经多年临床实践证实其能有效改善非增殖期DR 的临床症状和相关指标，如视力损害、眼底病变、血液动力学异常、糖化血红蛋白、尿微量白蛋白等，推测其疗效与其潜在功能相关[6-12]。

本研究使用TCMSP 平台确定了330 个三七与生蒲黄的共同靶点，其中甲酸（FMT，Degree=93）、槲皮素（quercetin，Degree=55）、山奈酚（kaempferol，Degree=28）等是中药有效成分网络的关键节点。运用Genecards、DrugBank、DisGeNET 及OMIM数据库，筛选出159 个药物与疾病的交集靶点。利用DAVID 生物信息学资源库，对药物-疾病靶基因GO和KEGG 进行了富集分析，发现三七配伍生蒲黄防治DR 的作用机制中AGE-RAGE、HIF-1 信号通路扮演了核心角色，主要涉及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、胰岛素（insulin，INS）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）等基因的表达。

GAPDH 被认为是DR 多途径激活的介质，高糖状态抑制了视网膜细胞中GAPDH 的活性，激活了细胞凋亡、蛋白激酶C 等致病途径，直接靶向修饰GAPDH 的药物具有控制DR 发展的潜力[15-16]。INS是由胰腺β 细胞分泌的一种蛋白质激素，是机体内唯一降低血糖的激素。CAT 是一种酶类清除剂，催化H2O2分解为H2O 和O2，使细胞免受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。IL-6 是肥胖和糖尿病研究中最突出的炎症细胞因子之一，其与特异性受体结合后，可激活MAPK 信号通路，参与DR 的炎症反应。VEGFA 是VEGF 家族的重要成员，在与其受体结合后，激活MAPK 信号通路，引发血管内皮细胞增殖和迁移，增加管壁通透性，参与DR 新生血管的生成[17]。由此可见，网络药理学的结果与上述结果相一致，表明三七配伍生蒲黄可调节以上基因的表达，从而影响DR 的发生发展。

AGE-RAGE 信号通路是糖尿病各种并发症发病机制的中心环节。血液中过高的葡萄糖与循环中大分子物质（如脂肪、组蛋白质等）通过非酶途径结合，生成稳定不可逆的AGEs 在细胞内外广泛积聚，导致周细胞凋亡和基底膜增厚，是DR 发生的重要原因[18]。而AGEs 的升高又可引起AGE 受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）表达显著上调，AGEs 与RAGE 结合可诱导活性氧增加，抑制GAPDH 的活性[19-20]；还可诱导VEGF 等促血管生成基因的表达，二者加速了周细胞凋亡和新生血管的生长[21-22]。此外，高血糖导致的网膜低氧状态，又使得HIF-1 信号通路被激活，同样刺激VEGF 的表达，诱导DR 新生血管生长[19]。抑制AGE-RAGE、HIF-1 信号通路介导的周细胞凋亡和新生血管生长，是防治DR 的重要途径，这与三七配伍生蒲黄防治DR 的关键靶基因及相关途径的网络药理学预测结果一致。

综上所述，三七配伍生蒲黄防治DR 的作用机制，主要涉及GAPDH、INS、CAT、IL-6、VEGFA 等靶点基因，通过调控AGE-RAGE、HIF-1 等信号通路，改善DR 的糖/脂/蛋白代谢异常、氧化应激以及炎症反应。本研究不足之处在于，仅从理论上预测关键靶基因及相关途径，也未考虑各成分间的相互干扰，有待进一步基于“中药-活性成分-靶点-通路-疾病”的实验，验证这一理论的可靠性。