慢性阻塞性肺疾病大鼠模型造模方法研究进展

尚金钰 付延鑫 高胜寒 纪思禹白亚虎 宁康

1.山东第一医科大学（山东省医学科学院）研究生部，山东济南 250017；2.潍坊医学院研究生部，山东潍坊 261053；3.山东第一医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，山东济南 250014

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持续的呼吸系统症状及气流受限为特征的一种常见、可预防、可治疗的疾病［1］。2017年全球疾病负担（global burden of disease，GBD）研究报告指出，慢性呼吸道疾病（chronicrespiratory disease，CRD）的流行病例为5.45亿例，其中COPD约占50%，是导致寿命减少的第7大原因［2］。目前关于COPD疾病的发生、发展的确切机制尚不明确，有效阻止或逆转疾病进展的疗法仍需进一步研究，因此COPD基础实验研究具有重要意义。能够较快建立稳定表现COPD标志特征的动物模型是实验成功的基础。现已开发的动物模型种类包括羊、犬、猪、兔、啮齿类动物和灵长类动物等，均可在一定程度上反映人类COPD的病理生理状况［3］。其中啮齿类动物（以小鼠、大鼠为代表）应用最为常见。小鼠与大鼠均有体积小、饲养成本低、繁殖周期短、生物学信息相对透彻等共同优点；但大鼠相比小鼠体格更强壮，气管、支气管更粗，更有利于进行气管内滴注试剂、肺泡灌洗、肺功能测定等操作［4-5］，在实验中更易存活。本研究主要总结近年COPD大鼠模型常用的建模方法。

1 单因素制备COPD大鼠模型

1.1 香烟烟雾（cigarette smoke，CS）暴露

吸烟是COPD的主要危险因素已是全球公认事实，啮齿类动物和人类呼吸道对CS的反应是相似的，CS暴露能真实模拟人类患病环境。全身烟雾暴露与单纯口鼻吸入CS相比，增加了大鼠皮毛等其他部位对主流及侧流烟雾成分的吸收，目前应用相对更多。王彩云等［6］在实验中将Sprague-Dawley（SD）大鼠置于自制的1 m×1 m×1 m烟熏箱内，使用红三环牌香烟（每支香烟焦油含量10 mg，烟碱含量0.8 mg，一氧化碳含量1.3 mg）烟熏，每天2次，每次1 h，持续12周后，模型组大鼠肺功能明显减退，出现支气管管腔严重变形和管壁增厚，肺泡间隔增厚且炎性细胞明显浸润，肺泡融合且肺泡数量减少等明显COPD病理改变。Wu等［7］将SD大鼠放入49.0 cm×31.5 cm×47.0 cm被动吸烟盒内，使用一品美香烟（每支香烟焦油含量11 mg，尼古丁含量0.8 mg，一氧化碳含量4 mg），以6%的烟雾浓度烟熏，每天2次，每次0.5 h，间隔8 h，共90 d，成功建立了肺功能降低且有明显COPD病理改变的大鼠模型。Han等［8］将中南海卷烟（每支卷烟含14 mg焦油、1.2 mg尼古丁和14 mg一氧化氮）放入烟化装置中点燃，每次每支香烟取30 mg烟雾（共20～25次），并以0.90 L/min的流速与50%的空气混合。将大鼠置于烟雾室中，使用仅鼻部暴露装置被动暴露于CS中，每次60 min，每天2次，8周后大鼠肺功能显著降低，肺部组织病理示：支气管变窄，气道上皮增厚，炎性细胞浸润，成功建立COPD大鼠模型。尽管CS暴露法有建模简单、成功率高等诸多优点，但也有研究显示，无论CS暴露时间多长，模型动物肺部病理表现仍旧较轻微且部分可逆［9］。

1.2 二氧化硫（sulfur dioxide，SO2）暴露

SO2是大气中常见的污染气体成分，高度可溶，进入呼吸道后形成酸性物质，可对细支气管及肺泡造成损害。研究表明，随着吸入SO2质量分数的增加，机体首先出现呼吸道纤毛运动和黏液分泌功能的抑制，继而引发痰液等分泌物清除减慢，导致气管上皮细胞损伤坏死，引发各种炎症，造成末梢小气道通气功能障碍，长此以往促使肺泡壁结构破坏，导致肺气肿［10］。由于遗传易感的自发性高血压（spontaneously hypertensive，SH）大 鼠 可 表 现 出COPD患者易出现的全身炎症、高凝状态、氧化应激和免疫功能抑制等表型，故在暴露于相同SO2浓度、相同时间条件时，SH大鼠相比于普通SD大鼠，更容易建成明显COPD表现的模型［11］。同时，经黏蛋白的气道病理学和形态计量学评估表明，SO2对SH大鼠的影响显著大于SD大鼠，显示出SH大鼠暴露在SO2中建立COPD模型的有效性。

1.3 PM2.5暴露

PM2.5是指环境空气污染中空气动力学直径小于2.5 μm的颗粒，因其粒径小、比表面积大，容易吸附各种有毒害成分的物质，从而组合成为一种复杂的混合物［12］。PM2.5可以穿过鼻毛过滤直接进入肺部并被吸收入血，引起肺泡上皮细胞损伤，激活免疫引发炎症，久之引起肺泡结构改变，降低肺功能。目前针对PM2.5的毒理机制研究主要集中在氧化损伤、炎性损伤和DNA损伤及突变方面，在COPD模型建立方面也有初步应用。Shimazu等［13］将10只健康雄性SD大鼠置于暴露室内通风的笼子中，隔壁室内以汽油动力摩托车作为颗粒物污染源，将大鼠暴露于机动车尾气中的PM2.5（1.46 mg/m3）中，每天4 h，每周5 d，7个月后，大鼠出现明显肺功能下降、肺泡腔及间质内炎细胞浸润、肺泡腔扩大等明显病理改变，建成COPD模型。Xue等［14］根据天津市居民的暴露条件，确定了大鼠气管内滴注PM2.5的剂量，以此构建COPD模型。天津市严重污染日PM2.5质量浓度可超过500 μg/m3［15］，人类的呼吸量为0.13 L/（min·kg）［16］，PM2.5在人类肺部的沉积率约为40%，依据上述参数估计人体肺部PM2.5的每日沉积量约为15.6 μg/kg。根据人到大鼠的滴注剂量转换系数（约为10）［17］，计算大鼠的等效剂量为156 μg/kg。在初步研究中，使用5 mg/kg的PM2.5悬浮液（0.1 mL）缓慢滴入大鼠气管，每5天滴注1次，滴注5次后发现只造成轻微的肺损伤。后将2组大鼠注入剂量分别改为7.5和15 mg/kg后发现两组模型组大鼠肺部均出现明显氧化应激、炎症浸润、细胞损伤以及支气管和肺泡壁结构被破坏等表现。由于颗粒物是复杂的混合物，故上述研究利用扫描电子显微镜、微束能量色散X射线光谱、电感耦合等离子体质谱和高效液相色谱等方法对颗粒进行了表征检测，相比于CS与SO2暴露，操作鉴定更复杂，但更贴近实际PM2.5环境污染的条件影响。尽管均是PM2.5暴露的条件，不同的建模方法在暴露方法、暴露时间、使用剂量上有很大区别，因此该模型的应用仍需进一步的研究优化。

1.4 气管内滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）

LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是由脂质和多糖构成的物质（糖脂质）。作为一种常见的内毒素，LPS通过存在于宿主细胞膜表面的Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）完成胞外刺激信号传入细胞内的转化，活化胞内信号转导通路［18-19］，从而激活炎症反应。刘君波等［20］将大鼠乙醚麻醉后用耳镜插入喉口，以静脉套管针向气管内注入200 μg LPS（用生理盐水配制成1 g/L溶液），每周1次，持续8周后，大鼠肺功能明显下降，病理切片示明显肺组织炎症、肺气肿样改变，建成COPD模型。该方法相较于气体暴露的造模方法，成模效率高，成模大鼠病理变化一致，更容易控制。

1.5 气管内滴注蛋白酶

蛋白酶-抗蛋白酶失衡是导致COPD的重要机制之一。气管内滴注蛋白酶，人为造成蛋白酶与抗蛋白酶失衡，使组织蛋白被水解、破坏，同时引发各种炎症机制，加重气道组织损伤，最终导致终末细支气管、肺泡结构破坏，造成肺气肿。常用的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、猪胰蛋白酶（pig pancreatic elastinase，PPE）、人中性粒细胞弹性蛋白酶。Ge等［21］将木瓜蛋白酶溶液以2 mg/mL的浓度、2 mg/kg的剂量从上到下注入SD大鼠气管中，通过将动物提起并旋转的方式确保药物完全进入气管至肺部，上述操作持续8 d，建成肺泡显著增大、肺功能降低的COPD肺气肿模型。该方法可观察到大鼠气道成纤维细胞显著的变化，适用于该方面作用机制的研究。

2 多因素联合制备COPD大鼠模型

相比单因素制备COPD大鼠模型，多因素联合制备更能建成较为符合COPD多种病理表现与临床表现的大鼠模型并缩短造模时间［22］。在建立COPD加重期模型时，多因素联合造模方法应用更多［23］。多因素联合制备COPD大鼠模型方法对实验大鼠负荷更重，对大鼠的健康状况要求更高［24］。

2.1 香烟联合LPS制备大鼠模型

Yang等［25］在证实肺康颗粒可改善COPD大鼠肺部炎症的研究中，将大鼠置于被动吸烟动物中毒系统中，点燃10支椰子树牌香烟（每支香烟含1.2 mg尼古丁、12 mg焦油和14 mg一氧化碳），进行每天2 h，每小时间隔15 min的全身CS暴露，持续20周；在第1天和第14天，将200 mL LPS溶液（1 mg/mL）滴入每只模型大鼠气管，建成COPD大鼠模型。Wang等［26］在硫化氢对COPD大鼠模型的保护作用及其对基因表达谱影响的研究中，将大鼠置于动态吸烟箱中，分别于第1～4天、第6～18天和第20～30天暴露于吸烟环境，每天2次，每次1.5 h；LPS溶液（500 μg/mL）注入模型大鼠气管，建立COPD大鼠模型。Li等［27］在第1天和第14天，将200 μL LPS（1 g/L）注入气管。从第2天到第28天（第14天除外），所有大鼠都被放置在一个密封的1 m3烟雾室中，将压力控制在标准大气压（101.325 kPa）下，每天持续吸入香烟30 min，建成明显COPD表现大鼠模型。康睿等［28］在阿比多尔对COPD大鼠气道炎症及气道黏液高分泌影响的实验研究中，在第1天和第14天采用腹腔注射6%水合氯醛麻醉大鼠，经气管注入200 μg（1 g/L）LPS溶液，并在第2～13天、第15～28天每天上午将大鼠置入熏烟箱内，每次点燃15支香烟，每次30 min，每天吸烟1次。用药结束后发现，大鼠肺泡灌洗液炎症因子明显增多，肺功能明显下降；Western blot和实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）示气道黏液高分泌，建成COPD大鼠模型。此种方法能建立具有明显气道炎症反应、气道重塑和肺气肿病理表现的COPD大鼠模型。

2.2 香烟联合细菌/病毒制备大鼠模型

Ma等［29］在补肺益肾颗粒联合电针对COPD大鼠TLR-4/NF-κB信号通路调节作用的研究中，采用烟草雾与肺炎克雷伯菌溶液联合的方式建立COPD大鼠模型，具体如下：在第1周到第12周，将SD大鼠每天2次暴露于浓度为（0.30±0.05）%的烟草烟雾中30 min，在前8周内，每隔5天将肺炎克雷伯菌溶液（0.1 mL，6×108CFU/mL）缓慢滴入大鼠鼻孔，12周后模型构建成功。Liu等［30］在研究有效成分组合改善COPD大鼠气道重塑的机制中，将SD大鼠于第1周到第8周，用浓度为（0.30±0.05）%的烟草烟雾刺激大鼠40 min，并交替向2个鼻孔注射0.1 mL（6×108CFU/mL）的肺炎克雷伯菌，成功建立了COPD大鼠模型，其肺组织病理显示平均线性截距增加、平均小气道壁厚度增加和平均肺泡数减少等严重的病理损伤。该研究表明，香烟联合细菌/病毒能有效制备大鼠COPD模型，更有利于对COPD的细胞信号转导通路作用机制的研究。

2.3 香烟联合蛋白酶制备大鼠模型

Wu等［7］在超声检测不同方法构建的COPD大鼠骨密度的差异研究中，将SD大鼠以6%的烟雾浓度吸烟，每天2次，每次0.5 h，间隔8 h，共90 d。在第30、32、34、36、60、62、64和66天，将大鼠放置在与超声波雾化器相连的雾化箱中，吸入含有木瓜蛋白酶的雾化液体（2 g/L，2 mL/次）。第90天大鼠出现喘息、咳嗽、呼吸短促、体质量减轻、面容疲惫、毛发暗淡、尿液发黄、大便干燥的症状。病理检测结果示肺泡平均直径增大，肺泡数量减少，肺泡融合。肺功能检查示大鼠通气功能降低，肺弹性阻力增加，肺顺应性降低等。成功建立了符合COPD临床表现及病理生理改变的模型。

2.4 LPS联合蛋白酶制备大鼠模型

De等［31］在内毒素诱导肺气肿加重模型的研究中，采用LPS联合蛋白酶法制备COPD加重大鼠模型，在前4周，每周给予Wistar大鼠鼻内滴注2 IU（20 IU/mL）猪胰蛋白酶，为了达到最大肺损伤状态，在停止滴注后第5周向气管内注入200 μg LPS（1 g/L），对模型大鼠分析动脉血气、肺部炎症和形态计量学、胶原纤维含量和肺力学，发现动脉氧合减少、肺泡塌陷、肺泡灌洗液炎症因子增多、肺泡间隔增厚、气道和肺血管壁中的胶原纤维沉积以及动态肺弹性增加［32-33］。

3 结论

单因素造模方法中，单纯香烟吸入是最常应用的造模方法，一般造模时间需达到12周［34］，但造模使用香烟的焦油量、烟碱量、暴露方式、吸入的烟雾浓度不统一，导致造模所需时间也未形成统一规范的数值。自从上世纪70年代Gross等［35］应用气管内滴注蛋白酶的方法成功制成COPD大鼠模型后，对于气管内滴注蛋白酶计量有了较明确的参照数值，但滴注间隔时间、具体操作手法在不同实验中仍各不相同。也有研究显示，此种造模方法建成的模型病理表现与人类患病时病理表现并不完全一致［36］。空气污染对COPD疾病发生发展的影响越来越受到人们关注，但PM2.5颗粒吸入、SO2吸入等建模方法目前应用仍相对较少，有待进一步探究。多因素复合造模方法较单因素建模所建模型病理表现更符合真实COPD疾病表现，但相应的，对大鼠耐受性要求也更高，CS吸入联合LPS气管内滴注是最常应用的造模方法。在COPD相关研究中对于COPD大鼠模型的评价根据各种实验要求的不同也各有不同，常用的包括大鼠精神状态、进食表现、体质量改变等一般状况，还有肺功能改变、肺组织病理学改变、影像学改变、血气分析改变、肺泡灌洗液炎症因子变化、血炎症细胞数量变化等［37］。

COPD作为严重威胁人类健康的常见病，是由多种因素诱导的一组临床综合征，其疾病发生发展机制涉及诸多介质以及多种细胞信号通路。不同COPD病情分期的临床表现、病理表现各不相同，目前，难以构建具有各分期典型症状的模型。而且大鼠由于遗传特点与人类不完全相同，难以完全模拟人类疾病表现。因此，在将来的研究中，仍需进一步总结各种造模方法的特点并积极开发新的造模方法，构建多种多样的能满足不同实验目的的COPD大鼠模型。

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