HPLC法测定叶酸原料中光学异构体的含量

赵琦，邹云红，李永贵*，孙清*

(1.山东省荣军总医院，山东 济南 250014；2.山东省药学科学院，山东省化学药物重点实验室，山东 济南 250101)

叶酸(folic acid)是B族维生素的一种，又称维生素B9、维生素Bc、维生素M，是一种抗贫血及预防新生儿出生缺陷的药物[1-3]。它集预防、治疗和保健于一身，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质，在体内以四氢叶酸的形式起作用，参与嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。House等[4-9]对叶酸对妇女孕育生命及不良生育新生儿神经管畸形的发生方面做了研究，缺乏叶酸会引起神经缺陷、动脉硬化、高血压、心血管疾病甚至癌症等。

叶酸由蝶啶环、对氨基苯甲酸和谷氨酸组成，分子中含有手性结构，存在光学异构体D-叶酸。药物的光学异构体在活性、代谢过程及药理毒理学方面与药物本身常常有显著差异，为提高药物活性、减小副作用，需要对药物中的光学异构体进行分离研究[10]。国家药品监督管理局药品审评中心发布的《第一批拟不推荐参比制剂化药品种药学研究技术要求》(征求意见稿)中明确要求对叶酸片(0.4 mg)中光学异构体进行研究，但目前叶酸各国药典标准中，均未提供叶酸光学异构体D-叶酸的检测方法。本研究建立了高效液相色谱法测定叶酸中光学异构体D-叶酸的检测方法，弥补了药典缺陷，为药典标准提供补充，更好的控制叶酸质量，保证叶酸的用药安全[11-13]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(岛津LC-20AT泵、SPD-M20A型PDA检测器)；分析天平(Sartorius BT125D)；pH计(梅特勒 SevenExcellence)；超纯水机(上海杲森仪器设备有限公司)。

1.2 试药 D-叶酸对照品(KLSSstandards 纯度：96.46%)；叶酸(河北冀衡集团有限公司)；甲醇(山东禹王实业有限公司，色谱纯)；乙腈(天津赛孚瑞科技有限公司，色谱纯)；三乙胺(天津大茂化学试剂厂，分析纯)；乙酸(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为大赛璐QN-AX手性色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇-乙腈-乙酸-三乙胺(50∶50∶2∶3)，流速0.6 mL·min-1；检测波长为280 nm，柱温为35 ℃，进样体积20 μL[14]。

2.2 样品制备 配样溶剂：3%三乙胺甲醇溶液。

D-叶酸对照品溶液：精密称取D-叶酸对照品约10 mg置100 mL量瓶中，加配样溶剂适量使溶解，用配样溶剂稀释至刻度，摇匀，作为D-叶酸储备液。精密量取D-叶酸储备液1 mL置100 mL量瓶中，加配样溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液：精密称取叶酸约10 mg置50 mL量瓶中，加配样溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.3 专属性试验 分别取“2.2”项下配样溶剂、对照品溶液、供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。结果表明，在本检测条件下，配样溶剂对D-叶酸测无干扰，D-叶酸与叶酸分离良好。

A.配样溶剂；B.D-叶酸对照品溶液；C.供试品溶液图1 专属性试验HPLC图谱

2.4 定量限与检测限 量取“2.2”项下对照品溶液，加配样溶剂稀释成不同浓度梯度的溶液，分别取20 μL注入液相色谱仪，测得D-叶酸定量限为2.50 ng(S/N≈10)，检测限为1.00 ng(S/N≈3)。

2.5 线性试验 量取“2.2”项下叶酸对照品储备液5 mL置100 mL量瓶中，用配样溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性储备液。分别精密量取线性储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置10 mL量瓶中，用配样溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液1～5。精密量取上述溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。以D-叶酸浓度C为横坐标，D-叶酸峰面积A为纵坐标做线性回归，求得回归方程Y=87 137X-5 179，R2=0.999 8，说明D-叶酸浓度在0.249 7～1.997 4 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

图2 D-叶酸峰面积与浓度线性关系图

2.6 溶液稳定性试验 取“2.2”项下对照品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图及峰面积。结果D-叶酸平均峰面积为81 122，RSD为0.99%，说明D-叶酸对照品溶液24 h内稳定。

2.7 仪器精密度试验 量取“2.2”项下D-叶酸对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图中D-叶酸峰面积A，结果D-叶酸平均峰面积为80 277，RSD为0.63%，表明仪器精密度良好。

2.8 回收率试验 精密量取“2.2”项下D-叶酸对照品储备液0.8、1.0、1.2 mL(约相当于D-叶酸限度的80%、100%、120%)置100 mL量瓶中，分别加入叶酸20 mg用配样溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，各浓度平行配制3份，依法测定，计算回收率，结果见表1。

表1 D-叶酸回收率试验结果(n=9)

2.9 样品检测 取叶酸3批，按照“2.2”项下方法配制供试品及D-叶酸对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别取20 μL注入色谱仪，记录色谱图及峰面积，按外标法计算，结果D-叶酸含量分别为0.049%、0.046%、0.043%。

3 讨论

3.1 检测波长选择 对D-叶酸对照品溶液进行全波长扫描，结果显示D-叶酸在280 nm波长处有最大吸收，因此选用280 nm检测波长进行检测。

3.2 配样溶剂选择 叶酸在水、乙醇、乙腈中溶解性差，在碱性溶液中易溶。研究过程中分别选用流动相、甲醇、乙腈、5%氨水溶液、四氢呋喃-甲醇-水-醋酸-三乙胺(10∶80∶10∶2.4∶3)、3%三乙胺甲醇溶液作为配样溶剂，结果叶酸在流动相、甲醇、乙腈均不能完溶解，在5%氨水溶液、四氢呋喃-甲醇-水-醋酸-三乙胺(10∶80∶10∶2.4∶3)、3%三乙胺甲醇溶液中可以完全溶解。由于叶酸在3%三乙胺甲醇溶液中溶解快速且与流动相接近，因此最终选用3%三乙胺甲醇溶液作为最终配样溶剂。

3.3 目前《欧洲药典》《日本药典》《美国药典》《英国药典》《中国药典》等多国药典均已收录叶酸质量标准，但均未对叶酸光学异构体进行控制。本研究建立了高效液相色谱法测定叶酸异构体D-叶酸的检测方法，并进行了方法学研究，结果表明该方法专属性强，可用于检测叶酸中异构体D-叶酸的含量。