ICP-MS法研究含朱砂中成药中的汞元素在人工胃液中的溶出特性

王辰洋，金鹏飞，胡欣

(1.山东大学齐鲁医院药剂科，山东 济南 250012；2.北京医院药学部，国家老年医学中心，中国医学科学院老年医学研究院，北京市药物临床风险与个体化应用评价重点实验室<北京医院>，北京 100730)

朱砂(主要成分是硫化汞)首载于《神农本草经》，又名丹砂辰砂，性甘、微寒；有毒，归心经；临床上用于心悸易惊，失眠多梦，癫痫发狂，小儿惊风，视物昏花，口疮，喉痹，疮疡肿毒[1]。近年来盲目使用含朱砂中成药的现象非常普遍，因服用朱砂导致不良反应或中毒事件时有发生[2-8]。由于硫化汞难以溶解，在人体内也不能被吸收，朱砂的毒性主要来源于其中含有的游离汞及可溶性汞[9]，因此不但要考虑中成药中汞总含量高低，更要研究其口服后在胃肠液中的溶出特性。

儿童各系统、器官功能尚未发育完善，更易受到损伤。就儿童而言，影响较大的是神经系统发育[10]。《中国药典》收录许多含朱砂的儿科中成药，以一捻金和小儿金丹片应用较多。一捻金由大黄、朱砂等五味中药制成，具有消食导滞、祛痰通便之功效，临床上主要用于脾胃不和、痰食阻滞所致的积滞[1]。小儿金丹片由朱砂、橘红、川贝母等26味中药制成，具有祛风化痰、清热解毒之功效，临床上主要用于外感风热、痰火内盛所致的感冒[1]。本文作者选取一捻金、小儿金丹片为代表，应用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)技术，测定不同厂家药品中的汞元素在水、人工胃液中的溶出特性，初步探讨可能被人体吸收的汞含量，为该药的安全性评价提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 7500a电感耦合等离子质谱(ICP-MS，配备Babington雾化器，镍采样锥和截取锥，美国Agilent公司)；MARS X-press密闭微波快速消解系统(美国CEM公司)；超纯水处理系统(法国Millipore公司)；梅特勒 XP 205电子天平(瑞士Mettler公司)；SHZ-A恒温振荡器(上海乔跃电子有限公司)；S10H 型超声仪[致微(厦门)仪器有限公司]。

Hg单元素标准溶液(C=1 000 mg·L-1，国家标准物质研究中心)；NIST西红柿叶标准物质(SRM1573a，美国国家标准与技术研究院)；调谐液：Li、Y、Ce、Tl、Co混合液(编号：5184-3566，C=10 μg·L-1，美国Agilent公司)；混合内标溶液(6Li、45Sc、72Ge、89Y、115In、159Tb、209Bi，C=10 mg·L-1，编号：5183-4680，美国Agilent公司)；浓硝酸(BV-Ⅲ级，北京化学试剂研究所)；盐酸(优级纯，北京兴青红精细化学品科技有限公司)；胃蛋白酶(Sigma公司)；超纯水由Millipore超纯水系统制得,其他化学试剂均为优级纯。

一捻金药品(市售)：①粉剂，厂家代码：YB，批号：2101031；②粉剂，厂家代码：YT，批号：130901；③胶囊，厂家代码：YF，批号：20130301。小儿金丹片药品(市售)：①薄膜衣片，厂家代码：DX，批号：AL29174；②薄膜衣片，厂家代码：DL，批号：130202。

2 方法

2.1 ICP-MS工作参数 RF功率：1 350 W，采样深度：7.8 mm，载气流速：0.96 L· min-1，蠕动泵转速：6 r·min-1，雾化室温度：2 ℃，干扰方程：EPA200-8，采样模式：spectrum，全定量，采样元素：待测元素(202Hg)和内标元素(209Bi)，元素的积分时间：0.1 s，重复次数：3次，采样前蠕动泵提升速度：12 r·min-1，提升时间：30 s，采样前蠕动泵平衡速度6 r·min-1，平衡时间：70 s。

2.2 内标溶液的制备 精密吸取混合内标溶液2.0 mL，以2%硝酸溶液(V/V)稀释成浓度为2.0 μg·L-1的混合溶液10 mL，摇匀，即得。

2.3 人工胃液的制备 取稀盐酸16.4 mL，加水约800 mL，加胃蛋白酶10 g，加水稀释成1 000 mL，摇匀，即得。

2.4 汞标准品系列溶液的制备 精密量取Hg单元素标准溶液1.0 mL，用2%硝酸溶液(V/V)稀释至100 mL，得到储备液Ⅰ(Hg 10 μg·mL-1)，再分别精密量取Hg储备液Ⅰ 0.50 mL，用2%硝酸溶液(V/V)稀释至100 mL，得到储备液Ⅱ(Hg 50 μg·L-1)，再分别精密量取储备液Ⅱ适量，用2%硝酸溶液(V/V)稀释制成浓度分别为0、0.2、0.5、1、2、5 μg·L-1的系列标准溶液。

2.5 汞总量测定供试品溶液的制备

2.5.1 取一捻金10袋，混匀，称取粉末0.05 g(约含Hg 2.44 mg)，精密称定，置耐高温高压的微波消解罐中，加入浓硝酸4 mL和浓盐酸1 mL，混匀，将消解罐置于50 ℃水浴中预消解10 min，取出，擦干，放冷，加盖内垫和外盖，置于微波快速消解仪中，以下列程序梯度升温消解：0～5 min升温至120 ℃，5～10 min恒温120 ℃；10～15 min升温至150 ℃，15～25 min恒温150 ℃；25～30 min升温至180 ℃，30～50 min恒温180 ℃。待消解完全后，放冷，消解液转移至100 mL聚乙烯样品瓶中，用超纯水定容后，摇匀，即得供试品溶液。供试品溶液用2%硝酸溶液(V/V)稀释2.5×104倍后进样测定。在制备供试品溶液的同时，不加样品只加硝酸同法制备试剂空白溶液，作为空白校正。

2.5.2 取小儿金丹片20片，粉碎、研成细粉，称取粉末0.05 g(约含Hg 7.62 mg)，精密称定，置耐高温高压的微波消解罐中，加入浓硝酸4 mL和浓盐酸1 mL，混匀，将消解罐置于50 ℃水浴中预消解10 min，取出，擦干，放冷，加盖内垫和外盖，置于微波快速消解仪中，以下列程序梯度升温消解：0～5 min升温至120 ℃，5～10 min恒温120 ℃；10～15 min升温至150 ℃，15～25 min恒温150 ℃；25～30 min升温至180 ℃，30～50 min恒温180 ℃。待消解完全后，放冷，消解液转移至100 mL聚乙烯样品瓶中，用超纯水定容后，摇匀，即得供试品溶液。供试品溶液用2%硝酸溶液(V/V)稀释2.5×104倍后进样测定。在制备供试品溶液的同时，不加样品只加硝酸同法制备试剂空白溶液，作为空白校正。

2.5.3 取NIST西红柿叶标准物质约0.05 g，精密称定，置耐高温高压的微波消解罐中，加入浓硝酸4 mL和浓盐酸1 mL，混匀，将消解罐置于50 ℃水浴中预消解10 min，取出，擦干，放冷，加盖内垫和外盖，置于微波快速消解仪中，以下列程序梯度升温消解：0～5 min升温至120 ℃，5～10 min恒温120 ℃；10～15 min升温至150 ℃，15～25 min恒温150 ℃；25～30 min升温至180 ℃，30～50 min恒温180 ℃。消解完成后电热板挥去硝酸，用2%硝酸溶液(V/V)定容到50 mL，不经稀释直接测定。

2.6 溶出汞供试品溶液的制备

2.6.1 一捻金人工胃液溶出液 取一捻金一次服用量(约含Hg 29.28 mg)，精密称定，置于锥形瓶中，加入人工胃液100 mL，37 ℃超声提取1 h，过滤，用少量人工胃液清洗滤渣3次，合并滤液并用人工胃液定容至200 mL，摇匀，13 000 r·min-1离心20 min，取上清液应用0.45 μm 滤膜过滤，取1 mL上清液，1%的盐酸溶液(V/V)定容到50 mL，摇匀，即得。

2.6.2 小儿金丹片人工胃液溶出液 取小儿金丹片粉末一次服用量(约含Hg 91.38 mg)，精密称定，置于锥形瓶中，加入人工胃液100 mL，37 ℃超声提取1 h，13 000 r·min-1离心20 min，取上清液应用0.45 μm 滤膜过滤，取2 mL上清液，1%的盐酸溶液(V/V)定容到50 mL，摇匀，即得。

2.6.3 一捻金水溶出液 取一捻金一次服用量(约含Hg 29.28 mg)，精密称定，置于锥形瓶中，加水100 mL，37 ℃超声提取1 h，过滤，用少量水清洗滤渣3次，合并滤液并用水定容至200 mL，摇匀，13 000 r·min-1离心20 min，取上清液应用0.45 μm 滤膜过滤，取1 mL上清液，1%的盐酸溶液(V/V)定容到50 mL，摇匀，即得。

2.6.4 小儿金丹片水溶出液 取小儿金丹片粉末一次服用量(约含Hg 91.38 mg)，精密称定，置于锥形瓶中，加水100 mL，37 ℃超声提取1 h，13 000 r·min-1离心20 min，取上清液应用0.45 μm 滤膜过滤，取2 mL上清液，1%的盐酸溶液(V/V)定容到50 mL，摇匀，即得。

2.7 测定 将空白溶液、标准品系列溶液、供试品溶液分别注入电感耦合等离子体质谱仪中，测定Hg元素和内标元素的信号响应值，根据标准曲线测得供试品溶液中Hg元素的浓度。

3 结果

3.1 方法学验证

3.1.1 线性范围和定量限 以汞元素和内标铋元素的响应比为纵坐标，以质量浓度为横坐标，由ChemStation软件自动绘制汞元素的标准曲线并计算线性相关系数和定量限(LOD)，汞元素在0～5 μg·L-1浓度范围内，线性方程为Y=0.0187 3X+0.019 16(r=0.999 5)，定量限为0.065 μg·L-1。结果表明：该方法的线性和灵敏度良好。

3.1.2 总汞测定的重复性和精密度 分别取一捻金粉末(厂家代码：YB)0.05 g和小儿金丹片粉末(厂家代码：DX)0.025 g，精密称定，按“2.5”项下的规定操作，平行测定6份样品，一捻金和小儿金丹片汞总量测定结果的RSD分别为7.4%和6.2%(n=6)，表明方法重复性良好。取其中一份一捻金和小儿金丹片供试品溶液，连续进样6次，汞元素响应与内标铋元素的响应比值的RSD分别为2.7%和2.6%(n=6)，表明系统精密度良好。

3.1.3 溶出汞测定的重复性和精密度 精密称取一捻金和小儿金丹片粉末各约一次服用量，按“2.6”项下的规定操作，平行试验6份，测定，结果显示，一捻金中汞元素在水、人工胃液的溶出率的RSD分别为39.2%和75.2%(n=6)，小儿金丹片中汞元素在水、人工胃液的溶出率的RSD分别为39.8%和48.6%(n=6)，溶出率很低，RSD很大。取其中一份一捻金和小儿金丹片溶出液，连续进样6次，结果显示：一捻金中汞元素在水、人工胃液的溶出率的RSD分别为8.8%和7.6%(n=6)，小儿金丹片中汞元素在水、人工胃液的溶出率的RSD分别3.1%和4.9%(n=6)，表明该方法精密度良好。

3.1.4 稳定性试验 分别取“3.1.2”项下汞总量供试品溶液与“3.1.3”项下水溶出液、人工胃液溶出液，于4 ℃冰箱内保存，分别在0、1、2、4、8、12、24 h测定，汞元素响应与内标铋元素的响应比值的RSD用于考察方法稳定性。一捻金和小儿金丹片汞总量供试品溶液在12 h内RSD分别为5.5%和9.6%。结果表明，12 h内稳定性良好。一捻金中汞元素在水、人工胃液溶出液2 h的RSD分别为10.6%和2.8%；小儿金丹片中汞元素在水、人工胃液溶出液的2 h 的RSD分别为2.2%和5.6%。结果表明，各溶液只在2 h内稳定，需要及时测定。

3.1.5 加样回收试验 分别称取一捻金约0.05 g和小儿金丹片粉末约0.025 g，各6份，精密称定，分别加入Hg单元素标准溶液(1 000 μg·mL-1)2 mL，按“2.5”项下的规定操作，测定，得到汞含量，以加标前后汞含量的差值除以加入的汞含量计算汞总量测定的回收率。取“2.6”项下的一捻金的水、人工胃液溶出液各1 mL或小儿金丹片的水、人工胃液溶出液各2 mL，各6份，分别加入“2.4”项下的汞储备液Ⅱ(50 μg·L-1)1 mL，用1%的盐酸溶液(V/V)定容到50 mL，测定，以加标前后汞含量的差值除以加入的汞含量计算溶出液汞测定的回收率。回收率结果见表1。汞总量回收率分别为89.48%和117.4%，汞在水、人工胃液中的回收率在103.2%～110.9%之间，满足分析的要求。

表1 汞总量测定及水、人工胃液中汞元素测定的回收率结果

3.2 标准物质测定结果 取标准物质约0.05 g，精密称定，按“2.5”项下的规定操作，平行试验6份，测定，计算Hg元素的含量。标准物质Hg含量的标准值为0.034±0.004，测定值为0.032±0.001(mean±SD,n=7)，测定值和标准值基本一致，表明方法具有较好准确性。

3.3 样品测定及结果分析 应用建立的方法对3个不同厂家的一捻金和2个不同厂家的小儿金丹片的汞总量以及在水与人工胃液中的溶出率进行了研究。每个样品平行试验6份，计算平均值，测定结果见表2。从测定结果分析，可得出以下结论：①按照《中国药典》2010年版规定的标准处方生产的一捻金中Hg的理论含量(以朱砂含HgS不少于96%计)应分别不少于46.85 mg·g-1，小儿金丹片小片Hg的含量在137.98 mg·g-1至168.17 mg·g-1之间，小儿金丹片大片Hg的含量在137.98 mg·g-1至166.73 mg·g-1之间，而测得各厂家一捻金中Hg含量分别为39.58、51.78、54.76 mg·g-1，各厂家小儿金丹片Hg含量分别为139.4、142.6 mg·g-1，表明某厂家一捻金胶囊存在朱砂投料不足的现象；②各厂家一捻金的Hg在人工胃液中的溶出率分别为0.002%、0.012%、0.020%，在水中的溶出率分别为0.025%、0.017%、0.018%，表明各厂家一捻金中的Hg在水和胃液中溶出率很低，并且溶出特性不同；各厂家小儿金丹片中的Hg在人工胃液中的溶出率均为0.004%，在水中的溶出率分别为0.011%和0.009%，提示各厂家小儿金丹片Hg在人工胃液中的溶出率和在水中的溶出率均很低，人工胃液中溶出率更低。各厂家一捻金和小儿金丹片在胃液中每天的溶出汞的量[胃肠溶出汞(μg·g-1)×每日剂量(g)]在1.11～11.59 μg之间。由于溶出率较低，对于这类药物的汞毒性值得进一步研究，其汞元素的限量标准也值得进一步探讨。

表2 一捻金和小儿金丹片汞元素总量、水中溶出率和胃液中溶出率

4 讨论

4.1 《中国药典》2010年版与2020年版关于一捻金和小儿金丹片的区别 由于作者做此试验之时，执行的是《中国药典》2010年版，而《中国药典》2010年版里只有一捻金[1]的质量标准，并且没有对HgS含量进行规定，因此用处方中朱砂百分含量(以朱砂含HgS不少于96%计)计算Hg的理论含量为依据。《中国药典》2020年版不仅增加了一捻金胶囊[1]的质量标准，还对一捻金和一捻金胶囊进行HgS含量测定，一捻金胶囊中规定的HgS含量折算成Hg含量(mg·g-1)应在40.24 mg·g-1至54.62 mg·g-1之间，一捻金粉剂中Hg含量应在39.53 mg·g-1至53.90 mg·g-1之间，按此标准，“3.3”项下结果测定依旧提示一捻金胶囊中朱砂投料不足的问题。对于小儿金丹片中HgS含量测定的范围，《中国药典》2010年版和2020年版[1]没有区别。

4.2 不同消解体系的选择 不同的消解体系对样品的破坏程度不同。本文研究了HNO3、HNO3-HF、HNO3-HCl-H2O2及不同比例HNO3-HCl体系，结果发现，HNO3和HNO3-HF体系消解后样品均有沉淀，不能完全消解；HNO3-HCl-H2O2体系用量比例分别为4.5∶1.5∶1、4∶2∶1、3∶3∶1、1.5∶4.5∶1及HNO3-HCl比例为4∶1消解后样品没有沉淀并且烟极少，均可消解完全；本着简单方便的试验原则，选用HNO3-HCl比例为4∶1作为样品消解条件。

4.3 消除记忆效应 试验中发现，在长时间测定汞元素过程中，会出现向上的基线漂移。汞对ICP-MS具有很强的记忆效应。故在测定汞标准曲线及进样过程中插入10%盐酸溶液 (V/V)淋洗进样系统，可较好消除汞元素的记忆效应，改善汞的回收率。

4.4 不同过滤方式及不同孔径滤膜的选择 本文研究了滤纸抽滤法、0.2、0.45和0.8 μm孔径滤膜过滤一捻金和小儿金丹片的水和人工胃液溶出液。用滤纸抽滤时，由于朱砂是极细粉入药，粉末颗粒过细，先过滤的滤液中有颗粒穿过滤纸进入滤液，而后沉淀堵住滤孔，致使每次过滤的结果都不一样。用0.2 μm孔径滤膜时，由于孔径过小，以及对颗粒的吸附导致滤液中汞含量大幅下降，0.8 μm孔径滤膜过滤溶出液后，由于粉末颗粒过细，滤液中仍有肉眼可见颗粒物存在，不仅颗粒堵塞仪器，也导致测定结果不准确。

从一捻金和小儿金丹片的分析结果来看，虽然含Hg量高，但只有不到0.02%可在胃液中溶出，下一步将继续对胃液中溶出汞的形态进行分析，从而为这类制剂汞毒性的评价提供参考，为我国矿物药的出口走向世界提供依据。