人参皂苷Rg1对H2O2诱导的HaCaT细胞氧化损伤保护作用研究

刘盈，周满如，周春

(1.广州新华学院药学院，广东 广州510520；2.南方医科大学药学院，广东 广州 510515)

人参皂苷Rg1作为人参皂苷中主要的活性成分之一，不仅存在于人参的根中，在其非药用部位茎、叶、花和果中也有较高的含量，具有抗氧化、抗炎、免疫调节及促进血管生成等多种药理作用。陈羡人等[1]研究表明，人参皂苷Rg1可通过提高体内抗氧化酶的活性，使血清和心肌丙二醛(MDA)水平明显降低，从而有效缓解糖尿病大鼠体内的氧化应激反应。容伟等[2]研究表明，人参皂苷Rg1可抑制MAPK/NF-κB信号通路，发挥对缺血后的脑组织的保护作用。此外人参皂苷Rg1可通过抑制Cytc释放、调控凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达发挥对高脂大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[3]，也可通过PERK-eIF2、ATF4信号通路保护神经元免受谷氨酸诱导的内质网应激[4]。但目前对于人参皂苷Rg1的研究大多数集中在其对心、肾、肝、大脑等组织脏器能量代谢紊乱上[5]，而关于人参皂苷Rg1对HaCaT细胞抗衰老的相关研究却甚少。本文以100 μg·mL-1H2O2诱导HaCaT细胞建立氧化应激损伤模型，探讨人参皂苷Rg1对H2O2诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤的保护作用及其可能机制，为今后人参皂苷Rg1在延缓皮肤衰老的研究进程中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人角质形成细胞(HaCaT cell)细胞株购自美国ATCC公司

1.1.2 药品与试剂 人参皂苷Rg1(纯度≥98%)(中国药品生物制品检定所)；CCK-8试剂盒(美国Biosharp公司)；Hochest33342试剂(美国Sigma公司)；30%H2O2试剂(天津市大茂化学试剂厂)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；10%胎牛血清(德国PAN Biotech公司)；PBS粉末(博士德生物)；活性氧检测试剂盒(广州碧云天生物公司)；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器设备 旋转蒸发仪(上海市贝仑仪器设备有限公司)；超净工作台(青岛海尔公司)；5%CO2培养箱(美国Thermo公司)；-80 ℃低温冰箱(美国Thermo公司)；酶荧光多功能检测仪(美国Biotek公司)；细胞培养板(美国Falon公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)；冷冻干燥机(日本EYELA公司)；离心机(Beckman Coulter公司)；蛋白印迹转膜槽(美国Bio-rad Criterion)；蛋白垂直电泳槽(赛默飞公司)；蛋白电泳仪(赛默飞公司)；FluorChem HD2 型化学发光凝胶成像仪(赛默飞公司)。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT细胞培养 取适量已活化的HaCaT细胞原液于含10%精制小牛血清和青霉素、链霉素各100 μg·mL-1的DMEM培养基中，于细胞培养箱(37 ℃、5% CO2)中培育。取生长对数期的HaCaT细胞，以1×105个/mL密度的细胞悬液接种于96孔细胞板中，每孔200 μL，常规培养(37 ℃，5% CO2)24 h，备用。

1.2.2 细胞损伤实验 将HaCaT细胞分为空白组和损伤组，每组设5个平行孔。损伤组以1×105个/mL密度的细胞悬液接种于96孔细胞板中，每孔200 μL，空白组加入相同体积培养基，培养24 h。采用CCK-8法筛选H2O2浓度的分组为25、50、100、150、200 mmol·L-1每组5个复孔。取出事先培养好的HaCaT细胞，将原培养基吸出后分别加入对应体积的0.03% H2O2溶液和DMEM培养基使每孔体积为200 μL，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养作用2 h。换培养基继续培养24 h，每孔分别加入5 μL CCK-8试剂作用3 h，充分染色后用酶标仪在450 nm波长下检测OD值。细胞存活率通过以下公式计算：存活率(%)=(OD处理/OD空白)×100%。

1.2.3 CCK-8染色法测定细胞存活率 将HaCaT细胞分为空白组、损伤组与人参皂苷Rg1保护组。空白组给予完全培养基，对照组加入H2O2溶液使体系终浓度为最佳损伤浓度；人参皂苷Rg1保护组分为3个浓度计量组：5、10、15 mg·L-1。先按浓度加入人参皂苷Rg1预处理2 h，再加入最佳浓度的H2O2溶液作用2 h进行氧化损伤。换培养基终止反应后再在37 ℃、5% CO2培养箱中培育24 h，每孔分别加入5 μL CCK-8试剂作用3 h，充分染色后用酶标仪在450 nm波长下检测OD值。计算每孔中细胞存活率。

1.2.4 Hochest染色观察细胞凋亡 将HaCaT细胞分为空白组、损伤组与人参皂苷Rg1保护组(15 mg·L-1)。24孔板中的细胞经预处理及培养后，使用PBS缓冲液反复清洗3次，加入Hochest33342荧光试剂，染色30 min。使用光学显微镜观察HaCaT细胞形态变化及凋亡情况。

1.2.5 活性氧检测试剂盒(ROS Assay Kit)测定细胞ROS水平 将HaCaT细胞分为空白组、损伤组与人参皂苷Rg1保护组，每组设5个平行孔，将HaCaT细胞接种到6孔细胞培养板中，每孔5 mL，接种密度为每孔1×105个细胞，培养24 h。人参皂苷Rg1保护组加入5、10、15 mg·L-1的人参皂苷，每孔250 μL，空白组和损伤组补充相同体积的DMEM空白培养基，孵育3 h。损伤组与人参皂苷Rg1保护组加入损伤浓度的H2O2，每孔250 μL，孵育2 h，孵育结束后移除培养基，PBS缓冲液清洗2次，按照ROS检测试剂盒的说明书步骤进行后续操作，最后置于激光共聚焦显微镜下检测荧光强度，激发波长488 nm，发射波长525 nm。以各组细胞荧光强度代表ROS水平。

1.2.6 Western blot检测增殖凋亡相关标志蛋白 将HaCaT细胞分为空白组、损伤组与人参皂苷Rg1保护组。每组设5个平行孔，将HaCaT细胞接种到6孔细胞培养板中，每孔5 mL，接种密度为每孔1×105个细胞，培养24 h。人参皂苷Rg1保护组加入5、10、15 mg·L-1的人参皂苷，每孔250 μL，空白组和损伤组补充相同体积的DMEM空白培养基，孵育3 h。损伤组与人参皂苷Rg1保护组加入损伤浓度的H2O2，每孔250 μL，孵育2 h，孵育结束后移除培养基，PBS缓冲液清洗2次，结束后，提取细胞总蛋白，Western blot检测caspase-3、caspase-6、caspase-8、GAPDH增殖凋亡相关标志蛋白的表达及磷酸化水平。

2 结果

2.1 H2O2损伤后 HaCaT细胞存活率 与空白组比较，25、50、100、150、200 mmol·L-1的H2O2损伤处理HaCaT细胞后，各组HaCaT细胞存活率均有下降(P<0.05)。在H2O2浓度为100 mmol·L-1时，细胞损伤率达50%左右，作为后续实验损伤组中H2O2的加入量(见图1)。

图1 不同浓度H2O2损伤后HaCaT细胞存活率

2.2 人参皂苷Rg1预处理后各组HaCaT细胞存活率 与空白组比较，H2O2损伤组HaCaT细胞存活率明显降低，与H2O2损伤组比较，5、10、15mg·L-1的人参皂苷Rg1保护组HaCaT细胞存活率明显升高，10、15 mg·L-1人参皂苷Rg1保护组中HaCaT细胞存活率升高最为明显，具有统计学差异(P<0.05)，表明人参皂苷Rg1对H2O2氧化损伤后的HaCaT细胞增殖有一定的作用(见图2)。

图2 人参皂苷Rg1预处理后各组HaCaT细胞存活率

2.3 人参皂苷Rg1预处理后各组HaCaT细胞凋亡情况 与空白组比较，H2O2损伤组细胞呈亮蓝色，出现细胞核皱缩，染色质聚集的现象，凋亡细胞数量明显增多，与H2O2损伤组比较，5、15 和15 mg·L-1人参皂苷Rg1保护组细胞凋亡数量明显减少，表明人参皂苷Rg1对氧化损伤后的HaCaT细胞凋亡有一定的抑制作用(见图3)。

图3 人参皂苷Rg1预处理后各组HaCaT细胞凋亡情况

2.4 人参皂苷Rg1处理后各组HaCaT细胞ROS水平 与空白组比较，H2O2损伤组细胞中ROS水平升高，与H2O2损伤组比较，5、15和15 mg·L-1人参皂苷Rg1保护组细胞中ROS水平均有所降低，表明人参皂苷Rg1在一定程度上可降低细胞中ROS水平(见图4)。

图4 人参皂苷Rg1处理后各组HaCaT细胞ROS水平

2.5 Western blot检测增殖凋亡相关标志蛋白 与空白组比较，H2O2损伤组细胞中caspase-3、caspase-6、caspase-8水平均有所升高，与H2O2损伤组比较，5、15和15 mg·L-1人参皂苷Rg1保护组细胞中caspase-3、caspase-6、caspase-8水平均有所降低，表明人参皂苷Rg1在一定程度上可降低细胞凋亡相关标志蛋白的表达(见图5)。

图5 Western blot检测增殖凋亡相关标志蛋白

3 讨论

ROS被认为是造成机体氧化应激的主要原因，包括氧自由基和非自由基的含氧产物，如羟自由基(-OH)、超氧阴离子(O2-)、脂质过氧化物(ROO-、RO-与ROOH)及过氧化氢(H2O2)等[6]。大量的ROS超出了机体清除能力，破坏了机体正常的氧化/还原平衡状态，造成蛋白质、脂质、核酸等生物大分子物质氧化损伤和功能紊乱，从而影响机体正常代谢。本研究发现,与H2O2损伤组比较，5、15 和15 mg·L-1的人参皂苷Rg1保护组中HaCaT细胞中ROS含量呈浓度依赖性降低，表明人参皂苷Rg1可通过抑制ROS产生和累积从而抑制细胞氧化应激损伤，提高细胞活力，维持正常细胞形态。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)是一类半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶族，是执行细胞凋亡的关键信号途径[7]。在正常的细胞内，caspase家族以非酶活性前体存在，经由细胞内外多种促凋亡的信号激活，进而介导凋亡。其可分为两大类，一类是起始触发蛋白caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10，另一类是效应执行蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-7。起始触发caspase在外来蛋白信号的作用下被切割激活，激活的起始caspase对效应执行caspase进行切割并使之激活，被激活的效应执行caspase通过对caspase靶蛋白的水解，导致程序性细胞死亡[8]。caspase-3 是凋亡最直接的执行者，caspase-8位于caspase-3的上游，构成级联激活[9]。在本研究中，与H2O2损伤组比较，5、15和15 mg·L-1人参皂苷Rg1保护组中，HaCaT细胞中caspase-3、caspase-6、caspase-8蛋白水平均有所降低，表明人参皂苷Rg1在一定程度上可降低细胞凋亡相关标志蛋白的表达。此外，caspase-8和caspase-3的水平变化一致，提示二者可能存在级联反应，caspase-8对caspase-3有一定程度的激活作用。

本研究采用100 μg·mL-1的H2O2诱导细胞，建立氧化应激损伤模型，发现人参皂苷Rg1可显著提高H2O2诱导氧化损伤的HaCaT细胞存活率，缓解细胞核的损伤状态，减少凋亡细胞数量，同时有效降低HaCaT细胞内ROS 水平，Western blot 检测结果显示人参皂苷Rg1一定程度上可降低细胞凋亡相关标志蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-8 水平，综上所述，人参皂苷Rg1对H2O2诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤具有一定的保护作用，其机制可能与增强细胞清除自由基能力及抑制凋亡相关。