玉米肽结合有氧运动抗肥胖作用及分子机制*

张杉杉，尹凯波，姚晓雪，王碧辉，卢文丽，李美琪，杨金梅，孙婴宁

(齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000)

近年来，随着民众生活水平的大幅提高，肥胖人数也逐年升高，青少年超重和肥胖率增加也备受关注[1]。久坐不动的生活方式以及过量糖类、脂肪和蛋白质摄入等不健康的饮食习惯会造成脂肪细胞过度分化和增殖，最终引起青少年肥胖[2]。研究显示：青少年过度肥胖会导致冠心病、糖尿病和脂肪肝等疾病发生，严重威胁着青少年的身体健康[3]。相比于健康少年，肥胖少年血脂代谢紊乱情况更为严重，其甘油三酯(triglyceride，TG)和总胆固醇(total cholesterol，TC)与健康少年相比明显升高，且肥胖程度与血脂代谢紊乱成正相关[4]。因此，预防肥胖尤其是青少年肥胖已成为当前亟待解决的世界性问题。

蛋白质的水解产物多肽因为没有蛋白质的空间结构，可以不经过消化直接被肠道吸收。运动后补充多肽可加快其吸收，有利于快速补充血液中的氨基酸含量[5]。玉米肽是利用蛋白酶水解或微生物发酵技术，从天然玉米蛋白中提取的一种新型小分子生物活性肽，其水溶性好且易被人体吸收[6]。有研究表明：玉米肽在醒酒、抗氧化、降血压、降血脂、抗疲劳和抗肿瘤等方面均具有显著作用[7-9]。但玉米肽对高脂饮食诱导小鼠的抗肥胖作用及其分子机制尚不明确。本研究旨在分析玉米肽与有氧运动相结合在高脂饮食诱导下对小鼠的抗肥胖作用，探索玉米肽与脂肪形成转录调控因子和脂质合成相关基因的关系，初步揭示玉米肽结合有氧运动的抗肥胖作用及分子机制，研究结果将有助于为预防肥胖和研发新型预防肥胖药物提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物：试验采用4 周龄SPF 级雄性ICR小鼠(Mus musculus)，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

试验材料：玉米肽，购自黑龙江省齐齐哈尔易翔食品有限公司。

试验试剂：甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Western-blot 配胶试剂购自Biosharp (中国上海)；PVDF 膜购自 Millipore(美国)；PPARγ、C/EBPα、FAS 和β-actin 抗体购自Beyotime (中国上海)。

1.2 仪器与设备

D-37 520 低温离心机(Kendro，德国)；电泳系统(君意东方，北京)；IMS-20 型制冰机(雪科，常熟)；FA2004N 型电子天平(菁海，上海)。

1.3 试验方法

1.3.1 动物处理

动物饲料准备：标准饲料购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司；高脂饲料配比参考那立欣等[10]的配制方法，在74.75%标准饲料的基础上添加猪油10%、蔗糖5%、蛋黄粉5%、麻油3%、胆酸钠0.25%和食盐2%；玉米肽高脂饲料参照吴海寰等[11]的蛋白质摄入量，在高脂饲料中加入玉米肽200 g/kg，室温下晾干。

25 只雄性4 周龄ICR 小鼠先给予标准饲料适应性喂养，后随机分为5 组(n=5)：①标准对照组(CON)，饲喂标准饲料；② 高脂组(DIO)，饲喂高脂饲料；③高脂玉米肽组(DCP)，饲喂玉米肽高脂饲料；④ 高脂运动组(DEX)，饲喂高脂饲料，同时进行每周6 次、每次60 min 的游泳运动；⑤ 高脂玉米肽运动组(DCE)，饲喂玉米肽高脂饲料，同时进行每周6 次、每次60 min的游泳运动。干预时间为8 周，在干预期间每周同一时间测量小鼠体质量并记录，干预结束后处死取材。

1.3.2 采集血液和器官样本

干预8 周结束，采用断颈法处死小鼠，处死前12 h 禁食不禁水。心脏取血，于4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，分离血浆获得血清，将血清转移至-80 ℃冰箱冻存。随后迅速取出小鼠肾周脂肪、皮下脂肪、附睾脂肪以及肝脏组织，用4 ℃预冷的生理盐水洗涤干净，滤纸吸干水分后用电子天平称量并记录；将附睾脂肪组织移入-80 ℃冰箱冻存，用于后续蛋白表达检测。

1.3.3 血清血脂指标测量

TG、TC、HDL 和LDL 含量采用ELISA 试剂盒(南京建成生物科技研究所)利用酶标仪进行测量，测量方法参照各试剂盒说明书。

1.3.4 Western-blot 检测

取附睾脂肪组织0.5～1.0 g，剪碎，液氮研磨，500 μL 裂解液冰上裂解10 min，每5 min 剧烈涡旋振荡1 次，4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，取上清液备用。根据上清的蛋白浓度调整各样品的上样量。蛋白质经SDS-PAGE 分离后，用湿转法将蛋白转到PVDF 膜上，5%脱脂乳封闭后，一抗采用anti-PPARγ (AF7797，1∶1 000)、anti-C/EBPα (AF2590，1∶1 000)、anti-FAS (AF 6861，1∶1 000) 及anti-β-actin 抗体 (AF0003，1∶1 000) 孵育；二抗(1∶5 000)孵育后使用双色红外荧光成像系统扫膜。

1.4 统计学分析

数据分布正态性采用Shapiro-Wilk 检验，非正态分布数据利用Minitab 17 Box-Cox 转换为正态分布数据后进行统计分析。采用 GraphPad Prism软件作图，采用SPSS 22.0 进行统计学分析，数据用“平均值±标准误”表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对组间均数的差异进行比较。统计结果P＜0.05 认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 玉米肽结合有氧运动对高脂小鼠体质量的影响

由图1 可知：与标准对照组(CON)相比，高脂组(DIO)小鼠体质量在干预1 周时升高，并持续至第8 周；干预2 周时，高脂运动组(DEX)、高脂玉米肽组(DCP)和高脂玉米肽运动组(DCE)小鼠的体质量呈低于DIO 组趋势，并持续至第8 周；干预7 和8 周时，DCE 组体质量显著低于DIO 组(P＜0.05)，说明玉米肽结合有氧运动能够显著抑制高脂饮食诱导的肥胖小鼠体质量增长。

图1 各组小鼠体质量变化Fig.1 Changes of body weight of mice in each group

2.2 玉米肽结合有氧运动对高脂小鼠脂肪组织和肝脏质量的影响

由图2 可知：与饲喂高脂饲料的DIO 和DEX组相比，DCE 组小鼠的附睾脂肪质量显著降低(P＜0.05)；且DCE 组小鼠的肝脏质量显著低于DIO组 (P＜0.05)。说明玉米肽结合有氧运动可以显著降低高脂饮食喂养的肥胖小鼠肝脏质量和体脂。

图2 各组小鼠脂肪组织和肝脏质量的变化Fig.2 Changes of fatty tissue and liver weight of mice in each group

2.3 玉米肽结合有氧运动对高脂小鼠血清血脂水平的影响

由图3 可知：与DIO 组和DEX 组相比，DCE组小鼠血清中TG 和LDL 含量显著降低(P＜0.05)，各组小鼠血清中TC 和HDL 含量均无显著差异(P＞0.05)。说明玉米肽和有氧运动相结合能显著抑制小鼠血清的TG 和LDL 含量。

图3 各组小鼠血脂水平变化Fig.3 Changes of lipid levels of mice in each group

2.4 玉米肽结合有氧运动对脂肪生成相关基因的蛋白表达量的影响

由图4 可知：与DIO 组相比，单纯添加玉米肽(DCP 组)对小鼠附睾脂肪的PPARγ 蛋白表达量、单纯运动(DEX 组)对FAS 蛋白表达量均无显著影响(P＞0.05)；与DEX 组相比，DCE 组PPARγ 和C/EBPα 蛋白的表达量显著降低(P＜0.05)，说明有氧运动的同时补充玉米肽可以有效降低脂肪细胞分化转录调控因子的表达。

图4 各组小鼠脂肪组织中PPARγ、C/EBPα 和FAS 蛋白的表达Fig.4 Expression of PPARγ,C/EBPα and FAS protein in fatty tissue of mice in each group

3 讨论

近50 年来，随着经济的快速发展，人们生活水平大幅提高，导致饮食习惯也发生改变。肉类、脂肪和高糖等食物的摄入，显著增加了儿童和青少年的肥胖率[12]，预防青少年肥胖已经成为亟待解决的世界性问题。虽然有氧运动能显著降低体脂含量并改善机体脂质代谢[13]，但单纯有氧运动与其他运动一样并不能使体质量发生显著改变[14]。本研究发现：单独补充玉米肽和单独有氧运动一定程度上可以起到预防肥胖的作用，但是效果并不显著；而有氧运动的同时补充玉米肽能降低小鼠体质量并显著降低小鼠附睾脂肪质量，说明玉米肽结合有氧运动能够更有效地抵抗肥胖。运动可以促进多肽类食物吸收[5]，而玉米肽本身具有一定的抗肥胖作用，在运动的同时补充玉米肽可使多肽充分吸收，抗肥胖效果更加显著。

肝脏是调节脂质代谢的重要器官，在维持脂代谢平衡中发挥着重要作用。过度肥胖是代谢相关脂肪性肝病的成因之一[15]。长期摄入高脂饮食会引起肝脏组织肿大，进而引起肝脏炎症[16]。有研究发现：玉米肽中富含的支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)通过胞质支链氨基酸转氨酶1 或线粒体BCAT2 进行可逆转氨化反应[17]，可保护非酒精性脂肪肝引起的肝损伤[18]。本研究结果显示：有氧运动与玉米肽相结合可以降低小鼠肾周脂肪、附睾脂肪和皮下脂肪质量，尤其是可以显著降低肝脏质量。肝脏本身并不储存脂肪，但是当脂质代谢动态失衡时，肝脏摄取的游离脂肪酸增加，同时游离脂肪酸内源性合成增加，并且甘油三酯运转出现障碍，最终导致甘油三酯堆积在肝细胞中，导致肝脏质量增加[19]。可以推测：有氧运动的同时补充玉米肽一方面可以保护非酒精性脂肪肝引起的肝损伤，另一方面可以通过降低肝脏质量对代谢相关的脂肪性肝病起到预防作用。

当身体摄入的能量过多，多余能量就会以甘油三酯的形式储存起来进而形成脂肪，脂肪的合成与分解决定了体内脂肪的含量[20]。有研究表明：高脂喂养的小鼠血清中TC 含量更高[21-22]，且长时间有氧运动可以降低血清中TG、TC 和LDL 含量，升高HDL 含量[23]。本研究发现：有氧运动与玉米肽相结合使高脂小鼠血清中的TG 和LDL 含量显著降低，说明玉米肽结合运动对改善肥胖小鼠血脂水平具有显著效果。

为了阐明玉米肽结合有氧运动抗高脂饮食小鼠肥胖作用的分子机制，本研究检测了脂肪细胞分化的正向调控因子和脂质合成相关基因的蛋白表达水平。PPARγ 属于核受体超家族，在脂肪组织中高表达，在脂肪形成过程中作为转录因子促进前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞[24]。转录因子C/EBPα 同样是脂肪细胞分化的关键因子[25]，在脂肪形成初期，活化的PPARγ 和C/EBPα 相互促进，二者通过正调控脂肪细胞脂肪酸结合蛋白、脂蛋白脂酶和脂联素的转录，进而促进脂肪细胞形成[26-27]。本研究发现：玉米肽与有氧运动相结合能显著抑制高脂小鼠附睾脂肪组织中PPARγ的蛋白表达，而且与单独有氧运动组小鼠相比，有氧运动同时补充玉米肽可以显著降低PPARγ和C/EBPα 的表达。可以推测：玉米肽结合有氧运动对于小鼠肥胖的抑制主要是通过改变PPARγ和C/EBPα 的蛋白水平从而影响前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，最终抑制脂肪组织的过度积蓄。玉米肽结合有氧运动的肥胖预防相比于其他减肥药品而言安全性更高，可以为研发相关药物提供新思路。

4 结论

玉米肽结合有氧运动能够有效降低小鼠体质量，减少体脂积蓄，降低血脂水平，抑制高脂饮食诱导的小鼠肥胖，这一作用可能与其调控脂肪分化促进因子PPARγ 的表达相关。