艾灸对阿尔茨海默病小鼠海马区突触超微结构的影响*

林瑶，赵百孝

北京中医药大学，北京 100029

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种常见的神经系统退行性疾病，其主要病理特征为老年斑、神经纤维缠结、神经元和突触的丢失等，临床表现为渐进的认知功能受损、人格改变等症状［1-2］。痴呆患者人数在全球已逾5千万，并随人口的老龄化逐年升高，其治疗和护理费用已成为沉重的经济负担。

研究发现，突触的病变可能是AD病理进程中的重要环节［3-5］。AD脑内突触的病理学变化主要表现为突触功能障碍［6］、突触形态结构损伤［7］和突触丢失［8-9］，且该变化可能在AD早期就已经出现，并导致了认知功能的障碍［10］。研究发现，对AD模型小鼠施加相应干预措施修复突触损伤后，认知功能减退的症状也随之减轻［11-13］。突触的病变可见于AD脑内的海马、内嗅皮质、额叶等区域，其中以海马区，尤其是CA1区突触的损伤与学习记忆能力减退的关系最为密切［14-15］。

艾灸干预可延缓AD相关的病理进程并提高认知能力，治疗AD具有一定的优势。但关于艾灸对AD模型脑内突触超微结构的影响尚未见报道。为进一步探究艾灸的作用机制，本研究以艾灸关元穴为干预方式，从突触结构的角度，探究艾灸对AD模型小鼠学习记忆能力和海马区突触形态结构的影响。

1 材料

1.1 动物18只6月龄雄性SPF级快速老化小鼠（senescence-accelerated mouse prone／8，SAMP8）及9只同月龄雄性正常老化小鼠（senescence-accelerated mouse／sesistance1，SAMR1），体质量（30±3）g，购于中科泽晟科技有限公司［许可证号：SCXK（京）2014-0011］。饲养于北京中医药大学SPF级实验室，室温为（22±2）℃，湿度为50%～60%，12 h光照和黑暗交替循环，小鼠自由摄食饮水。所有操作均遵循北京中医药大学动物伦理委员会的规定，伦理批号：BUCM-4-2018060406-2010。

1.2 试剂特制艾条（河南南阳汉医艾绒有限公司，规格：φ0.5 cm×18 cm）；40 ng·L-1多聚甲醛（Mreda，货号：m051361）；25 ng·L-1戊二醛溶液（Acros，货号：c11998）、枸橼酸铅溶液（南京森贝伽生物科技有限公司，货号：A93278）；体积分数3%醋酸双氧铀染色液（北京生东科技有限公司，货号：130452）；锇酸（上海劲马生物科技有限公司，货号：C311498）；环氧丙烷（上海桑戈生物科技有限公司，货号：E117349）。

1.3 仪器Epon812包埋剂（上海易微信息科技有限公司，货号：RS116119）；透射电子显微镜（美国赛默飞，型号：TECNAISPIRIT）；超薄切片机（德国莱卡，型号：ULTRACUT UCT／UC6）；小鼠固定器（北京冀诺泰公司，规格：150 cm×65 cm）；Morris水迷宫实验仪（上海欣软信息科技有限公司，型号：XRXM101）。

2 方法

2.1 小鼠分组用随机数字表法将SAMP8小鼠随机分为模型组和艾灸组，每组9只，9只SAMR1小鼠为空白组。艾灸组小鼠被实验人员束缚于专用固定器中，以艾条灸关元穴20 min。模型组和空白组小鼠采取相同抓取并固定20 min，但不做其他干预措施。每天干预1次，每周干预6 d，共持续6周。艾灸时不断调节艾条与小鼠关元穴的距离，以维持艾灸温度的恒定。

2.2 检测小鼠学习记忆能力干预治疗6周后，采用Morris水迷宫实验检测各组小鼠学习记忆能力。水迷宫的实验装置为一个圆形水池（高60 cm，直径150 cm），被平均分为4个象限，其中平台（直径5 cm）位于第三象限，每个象限的池壁上贴有相应的标记物。在定位航行实验中，小鼠面朝池壁从一、二、四象限依次被放入水中，若小鼠在60 s内爬上平台，使其在平台停留10 s，并将其找到平台所用时间记录为逃避潜伏期；若小鼠在60 s内未找到平台，则会被引导至平台，停留10 s，记录逃避潜伏期为60 s。该实验共持续4 d。定位航行实验结束24 h后进行空间探索实验：实验人员移走平台，将小鼠从第一象限面向池壁放入水中，记录小鼠60 s内穿越平台次数、目标象限游程比、目标象限停留时间比。

2.3 透射电镜观察小鼠突触超微结构Morris水迷宫实验后，每组随机选取3只小鼠，用透射电镜观察其海马CA1区神经元突触的形态结构，并计算突触界面结构参数。具体步骤：用体积分数10%水合氯醛麻醉小鼠，并以40 ng·L-1多聚甲醛灌注后，取小鼠海马CA1区组织1 mm3大小用25 ng·L-1戊二醛固定液固定，1%锇酸再固定，乙醇逐级脱水后，Epon812包埋，超薄切片。样品经醋酸铀及枸橼酸铅双重染色后，用透射电镜观察各组小鼠海马CA1区Gray I型突触的超微结构。每只小鼠随机选取10个突触，每组小鼠共选取30个突触，计算突触界面结构参数。其中，突触间隙的宽度采用多点平均法测量，突触后致密物（postsynaptic density，PSD）厚度测量参照Guldner［16］的方法，突触界面曲率测量参照Jones等［17］的方法。

2.4 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件处理数据。若数据符合正态分布且方差齐，即以平均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，并用LSD法进行两两比较；否则采用非参数检验。定位航行实验结果采用重复测量数据方差分析。P＜0.05被认为有统计学意义。

空间探索实验显示：与空白组比较，模型组小鼠穿越平台次数、目标象限停留时间比、目标象限游程比显著减少（P＜0.01）；与模型组比较，艾灸组小鼠目标象限游程比显著减少（P＜0.05），穿台次数、目标象限停留时间比无显著性差异（P＞0.05）。见图2。

图2 各组小鼠空间探索实验结果

3.2 艾灸对小鼠海马CA1区突触超微结构的影响

各组小鼠海马CA1区突触形态：空白组小鼠突触结构清晰、完整，突触小泡丰富且分布密集，PSD较厚；模型组小鼠突触结构模糊不清，突触小泡减少，PSD变薄；艾灸组小鼠突触结构较清晰，突触小泡较多、分布较密集，PSD较厚。见图3。

图3 各组小鼠海马CA1区突触超微结构（×26 500）

3 结果

3.1 艾灸对小鼠记忆的影响定位航行实验显示：各组小鼠的平均逃避潜伏期随着训练天数的增加呈现下降趋势。与空白组比较，模型组小鼠平均逃避潜伏期显著升高（P＜0.05）。训练最后一天，与模型组比较，艾灸组小鼠平均逃避潜伏期均显著下降（P＜0.05）。见图1。

图1 各组小鼠定向航行实验平均逃避潜伏期

各组小鼠海马CA1区突触界面结构参数：与空白组比较，模型组突触界面曲率、PSD厚度显著减小，突触间隙显著增宽（P＜0.01）；与模型组比较，艾灸组突触间隙显著减小，PSD厚度显著增大（P＜0.05），突触界面曲率无显著性差异（P＞0.05）。见图4。

图4 各组小鼠海马CA1区突触界面结构参数

4 讨论

关元穴是足三阴经和任脉的交会穴，具有温肾壮阳、培补元气的作用。《扁鹊心书》也记载：“人于无病时，常灸关元、气海、命门、中脘，虽未得长生，亦可保百余年寿矣”，认为艾灸是益寿延年的抗衰老要穴［18］。本课题组前期研究发现，艾灸关元穴可以通过调节线粒体功能-能量代谢途径改善AD模型小鼠脑内氧化应激状态、减轻神经元的凋亡［19］，通过上调PI3K／AKT通路，减少脑内β淀粉样蛋白的产生［20］，通过mTOR信号通路提高海马的自噬水平，减少Aβ及磷酸化tau蛋白含量［21］，调节海马突触可塑性相关蛋白的表达［22］等途径提高AD模型小鼠的学习记忆能力，说明艾灸治疗AD具有多靶点的优势。本研究从突触的角度进一步探究了艾灸治疗AD的作用机制。

突触由突触前膜，突触间隙和突触后膜构成，负责传递神经元的信息，是学习记忆产生的关键部位［23］。突触界面结构参数定量描述了突触超微结构的变化，是突触形态结构变化的客观指标［24］。目前常用的突触界面结构参数有突触间隙宽度、突触界面曲率、PSD厚度、突触活性带长度等［25］。PSD是一层位于突触后膜的致密物质，含有神经递质受体、信号分子以及细胞骨架蛋白等，其厚度与突触功能呈正相关［26］。突触间隙是突触间的缝隙，该间隙的增大会增加神经递质传递时的损耗，因此突触间隙的宽度与神经递质传递效率呈负相关。突触界面曲率描述了突触连接界面的弯曲程度，体现突触接触面积的大小，与神经递质传递效率呈正相关［27］。

目前研究发现，AD模型小鼠学习记忆能力下降，脑内突触形态结构异常，而针灸干预可改善突触结构并提高AD模型小鼠认知功能［28］。李斐斐等［29］发现，SAMP8小鼠经电针治疗后电镜下海马CA1区突触形态结构改善，突触小泡增多，学习记忆能力增强，与王颖等［30］和杨文丹等［31］的研究结果类似。此外，卢圣锋等［32］发现电针SAMP8小鼠的“百会”“涌泉”穴后，其学习记忆能力显著增强，海马区突触间隙减小且PSD增厚，但突触界面曲率无显著性差异。类似的研究也表明，电针治疗可缓解AD鼠认知障碍，使海马区突触间隙减小，PSD增厚、突触界面曲率增大［33］。本研究结果显示，SAMP8小鼠经艾灸治疗后Morris水迷宫行为学成绩提高，电镜下可见其海马区突触超微结构改善，突触间隙显著减小、PSD显著增厚，与上述研究结果一致。

本研究发现，与模型组比较，经艾灸关元穴6周后，SAMP8小鼠Morris水迷宫平均逃避潜伏期显著缩短，空间探索实验的目标象限游程比显著升高，电镜下突触超微形态结构改善，突触间隙显著减小、PSD显著增厚，提示艾灸能够修复受损的突触结构，增强海马神经元的功能，提高AD模型小鼠的学习记忆能力。

综上所述，艾灸关元穴能够提高阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆能力，作用可能与其促进突触形态结构的恢复有关。