植物乳杆菌-辣椒复合发酵剂对肥胖2型糖尿病小鼠的减肥及降血糖作用

姜林娟，朱绍辉，郑 志，朴丙熙，姚三巧

1)新乡医学院公共卫生学院卫生毒理学教研室 河南新乡 453000 2)新乡医学院第一附属医院胃肠减重外科 河南卫辉 453100 3)韩陵医药研究院有限公司 南京211100 4)莱帕坚(株)公司 韩国首尔 04393

肥胖和2型糖尿病是常见伴发病，肥胖程度与糖尿病发病率显著相关[1]，肥胖和糖尿病已成为全球性公共卫生治理的新挑战。目前，调节饮食、适当运动、药物治疗等措施对肥胖患者血糖的长期控制及胰岛素抵抗的改善效果并不理想。有研究[2]发现辣椒的主要活性物质是辣椒素，它是一种香草酰胺类生物碱，通过调节褐色脂肪组织和白色脂肪组织释放脂肪细胞因子，从而改善肠道菌群结构，降低淀粉酶分泌,发挥减重功效；此外，它还能通过调节胰岛素受体数量及敏感性等途径，发挥降脂功效。然而，食用辣椒素会给口腔及胃部带来强烈灼烧刺痛感，不宜于肥胖的膳食治疗。本研究通过益生菌(植物乳杆菌BHN-LAB 33)发酵工艺，制成益生菌-辣椒复合发酵剂(益-辣复合发酵剂)，改良口感，探讨其对肥胖2型糖尿病小鼠体重、血脂、胰岛素抵抗及胃肠组织的影响，为肥胖及与之伴随的糖尿病的膳食治疗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料5周龄雄性C57BL/6N小鼠、普通灭菌饲料、灭菌垫料购自北京维通利华实验动物技术公司，质量分数45%脂肪供能高脂饲料购自江苏协同医药生物工程公司。BHN-LAB 33由韩国莱帕坚(株)公司赠送，小鼠血清总胆固醇ELISA试剂盒购自美国Abcam公司，甘油三酯ELISA试剂盒购自美国Abbkine公司，小鼠血清胰岛素ELISA试剂盒购自美国Invitrogen公司。MRS培养基和胰蛋白胨大豆肉汤购自青岛海博生物公司，辣椒和辣椒粉购自河南封丘某辣椒加工销售坊。TRPV1、Caspase-3一抗和二抗购自美国圣克鲁斯生物技术公司。

1.2 益-辣复合发酵剂和无发酵辣椒剂的制作将BHN-LAB 33放入MRS培养基中，37 ℃培养48 h进行活化。将活化后的植物乳杆菌放入100 mL胰蛋白胨大豆肉汤中，调到5×106CFU/mL(pH=7.4)，再放入100 g无菌辣椒粉，37 ℃发酵72 h，用体积分数78%乙醇提取，滤纸过滤(0.48 μm)、挥发溶媒、冷冻干燥后，即为益-辣复合发酵剂。同样，将100 g无菌辣椒粉放入到100 mL胰蛋白胨大豆肉汤中，37 ℃放置72 h(无需发酵)，用体积分数78%乙醇提取，通过上述同样步骤，即得无发酵辣椒剂。

1.3 肥胖2型糖尿病小鼠的建模[3]5周龄雄性C57BL/6N小鼠，饲养环境温度为(22±2) ℃，湿度为(55%±3%)，光暗周期12 h，单笼饲养，自由饮水饮食，每天称重1次。小鼠适应性饲养1周后，用高脂饲料连续饲养8周；在第8周时，体重比正常增高30%、空腹血糖达到7 mmol/L的小鼠为肥胖小鼠造模成功。

1.4 实验分组取模型小鼠35只，采用随机数字表法分为肥胖对照组(高脂饲料喂养)、高脂+无发酵组(高脂饲料加质量分数2.5%无发酵辣椒剂喂养)、高脂+发酵1组(高脂饲料加质量分数1.0%益-辣复合发酵剂喂养)、高脂+发酵2组(高脂饲料加质量分数2.5%益-辣复合发酵剂喂养)、高脂+发酵3组(高脂饲料加质量分数5.0%益-辣复合发酵剂喂养)5组；另设普通饲料喂养的小鼠(7只)作正常对照。喂养10周后，小鼠空腹12 h，乙醚麻醉，开腹，心脏采血，取肝脏、睾丸脂肪、胃和结肠组织。血液低温离心取上清液(血清)，放入4 ℃冰箱备用。将肝脏和睾丸用生理盐水洗3次，拭干后称重。观察胃和肝脏组织颜色、硬度，是否出血等，生理盐水清洗3次后，放入40 g/L多聚甲醛液中固定3 d。所有动物实验均在新乡医学院伦理委员会的伦理审查和监督下完成。

1.5 各组小鼠体重、每日食物摄取量、食物增重效益的测定分组喂养后，每周同一时间测体重。记录每周饲料量，减去剩余饲料量，即为每周食物摄取量。每周食物摄取量除以7为每日食物量摄取。食物增重效益=体重增重/总食物摄取量×100%。

1.6 各组小鼠血清胰岛素和胰岛素抵抗指数、总胆固醇和甘油三酯的测定采用ELISA试剂盒检测血清胰岛素、总胆固醇、甘油三酯水平。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)按照文献[4]方法计算。

1.7 各组小鼠睾丸脂肪组织中TRPV1和Caspase-3蛋白表达的Western blot检测小鼠处死以后，取50 mg的睾丸脂肪组织，匀浆，低温高速离心，收集上清液，用Bradford蛋白定量试剂计算蛋白浓度。蛋白上样量为50 μg，100 g/L SDS-PAGE电泳，蛋白转印至PVDF膜后于50 g/L脱脂奶粉液中封闭；加TRPV1和Caspase-3一抗(均按1∶1 000稀释)，室温下过夜孵育，TBST洗3次；加二抗孵育2 h，TBST洗3次；最后用ECL化学发光液显色，利用ECL Plus蛋白质印迹检测系统拍照并分析。

1.8 各组小鼠胃和结肠组织的形态学变化将固定好的胃和结肠组织水洗，依次经无水乙醇溶液脱水，用二甲苯和石蜡混合液进行包埋和切片(厚度为5 μm)，烘干，HE染色和封片，用Pannoramic MIDI数字切片扫描仪扫描拍照，观察上皮细胞和绒毛等结构出血、炎症浸润等情况。

1.9 统计学处理采用SPSS 25.0处理数据，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组小鼠体重、每日食物摄取量、食物增重效益、肝脏和睾丸脂肪质量，小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、胰岛素、HOMA-IR，小鼠睾丸脂肪组织中TRPV1和Caspase-3蛋白表达的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠体重、每日食物摄取量、食物增重效益、肝脏和睾丸脂肪质量的测定结果见表1。由表1可知，与正常对照组相比，肥胖对照组小鼠体重、食物增重效益、肝脏和睾丸脂肪质量均增加(P<0.05)。高脂+发酵组和高脂+无发酵组小鼠体重、睾丸脂肪质量均降低(P<0.05)；高脂+发酵2和3组小鼠的食物增重效益、肝脏和睾丸脂肪质量均低于高脂+无发酵组(P<0.05)，且以高脂+发酵3组最低。

2.2 各组小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、空腹葡萄糖、胰岛素、HOMA-IR的检测结果见表2。由表2可知，与正常对照组相比，肥胖对照组小鼠总胆固醇、甘油三酯、空腹葡萄糖、胰岛素、HOMA-IR表达均增加(P<0.05)。高脂+发酵组和高脂+无发酵组小鼠甘油三酯和胰岛素均降低(P<0.05)；高脂+发酵2和3组小鼠的总胆固醇、甘油三酯、空腹葡萄糖、胰岛素、HOMA-IR均低于高脂+无发酵组(P<0.05)，且以高脂+发酵3组最低。

表1 各组小鼠体重、每日食物摄取量、食物增重效益、肝脏和睾丸脂肪质量的比较

表2 各组小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、空腹葡萄糖、胰岛素、HOMA-IR的比较

2.3 各组小鼠睾丸脂肪组织中TRPV1和Caspase-3蛋白表达的结果见图1和表3。由表3可知，与正常对照组相比，高脂诱导的肥胖对照组小鼠睾丸脂肪组织中TRPV1和Caspase-3表达均降低(P<0.05)。高脂+发酵组和高脂+无发酵组小鼠的TRPV1和Caspase-3表达均提高(P<0.05)；高脂+发酵2和3组小鼠的Caspase-3表达增加效果均优于高脂+无发酵组(P<0.05)，且以高脂+发酵3组最优。

2.4 各组小鼠胃和结肠组织形态的变化结果见图2。由图2可知，与肥胖对照组小鼠相比，其他干预组小鼠的胃上皮无明显破损，无出血、溃疡、细胞增生、炎症因子等(图2A)；小肠和大肠的上皮细胞均无明显损伤，结肠绒毛长度、隐窝深度及黏膜厚度均无异常(图2B)。

1：正常正常组;2：肥胖对照组;3：高脂+无发酵组;4：高脂+发酵1组;5：高脂+发酵2组;6：高脂+发酵3组

表3 各组小鼠睾丸脂肪组织中TRPV1和Caspase-3表达(n=7)

A：胃组织(HE，×20)；B：结肠组织(HE，×10)；1：正常对照组；2：肥胖对照组；3：高脂+未发酵组；4：高脂+发酵1组；5：高脂+发酵2组；6：高脂+发酵3组

3 讨论

有研究[5]报道，含天然香辛料的食品具有抗肥胖功效，经常食用辣椒能增加饱腹感、减少食欲、加快能量代谢、调节脂代谢。研究[6]发现，地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis，SK1230)发酵的质量分数5.2%辣椒粉可改善高脂饮食小鼠脂肪积累。本研究发现，与质量分数2.5%辣椒剂相比，益-辣复合发酵剂对肥胖2型糖尿病小鼠具有更显著的减重、减脂、降糖功效及良好的调节胰岛素抵抗效果。本研究还发现，益-辣复合发酵剂对小鼠的胃和肠组织无损伤。

3.1 益-辣复合发酵剂的减重作用BHN-LAB 33是一种常见植物乳酸菌。乳酸菌能维持肠道黏膜屏障，调节肠道菌群平衡，抑制肠道细菌过度繁殖，减少细菌移位和内毒素产生，可以缓解胃肠道疾病，促进营养吸收。目前，植物乳杆菌与肥胖相关机制还不清楚。在高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中，弯曲乳杆菌与植物乳杆菌均能降低胆固醇和肝脏脂质含量，但对BMI和甘油三酯浓度没有影响[7]。本研究涉及的辣椒素对糖尿病大鼠脂质紊乱具有良好改善作用，并最终达到降低体重的目的。因此，植物乳杆菌与辣椒素可能具有协同效应，提高抗菌作用，共同调节肠道菌群紊乱，改善代谢紊乱。此外，长期摄取高脂食物导致肝脏肥大和体内脂肪蓄积，而益-辣复合发酵剂对肝脏和睾丸周围脂肪的质量具有显著地减重功效。

3.2 益-辣复合发酵剂的降脂降糖作用长期高脂肪摄取导致高脂血症，表现为体内的高胆固醇、甘油三酯增高。本研究结果显示：益-辣复合发酵剂能显著抑制体内总胆固醇、甘油三酯、空腹葡萄糖及空腹胰岛素，其以质量分数(5.0%)的益-辣复合发酵剂效果最优。有研究[8]报道，辣椒素对糖尿病的脂质代谢作用，可能是通过降低肠道脂肪酶的活性，促进粪便中胆汁酸含量和中性固醇排除，降低胆固醇和甘油三酯、肝脏胆固醇含量，减轻肝脏脂肪堆积，从而改善体内脂质代谢。这与本实验的降脂结果一致。本研究还发现益-辣复合发酵剂通过降低空腹胰岛素和空腹葡萄糖表达，可以发挥较好地调节胰岛素抵抗功效。

3.3 减重靶点为TRPV1通路传统辣椒主要成分辣椒素是瞬时受体电位香草醛亚家族(Transient receptor potential vanilloid subfamily 1,TRPV1)受体激动剂，而TRPV1通路可以通过以下途径[9]调控脂肪代谢：①促进速激肽类释放，延长胃排空时间，产生饱腹感。②抑制脂肪的生成和脂肪细胞的分化。③促进棕色脂肪组织产热反应，增加机体能量消耗。Hsu等[10]报道，辣椒素在脂肪细胞中通过激活Caspase-3、诱导凋亡和抑制脂质积聚的作用，抑制脂肪生成。因此，寻找抗肥胖功效的研究中，传统食品天然辣椒在健康与安全性上具有先天的优势。

3.4 益-辣复合发酵剂对小鼠胃和结肠组织形态的影响胃和小肠是营养物质消化吸收的重要器官，而胃和小肠黏膜结构与功能的完整状态是正常发挥消化吸收作用的生理学基础。因此，消化系统消化道的绒毛长度、隐窝深度及黏膜厚度等是衡量营养吸收功能的重要指标。研究[11]表明，在饲料中添加不同质量分数(0，0.62%，1.25%，2.5%，5.0%)的辣椒粉，不会对大鼠产生显著的不良反应。但程亚娇等[12]报道，辣椒素低[3.0 mg/(kg·d)]、中[6.0 mg/(kg·d)]、高[9.0 mg/(kg·d)]剂量灌胃大鼠28 d，发现结肠绒毛数目和褶皱数减少，隐窝深度加深，肠绒毛长度变短，而高剂量组绒毛部分受损严重，表明辣椒素对结肠组织有一定的破坏作用。本研究结果显示，与肥胖对照组相比，喂食的不同质量分数(1.0%，2.5%，5.0%)益-辣复合发酵剂，小鼠小肠和大肠的上皮细胞均无明显损伤，结肠绒毛长度、隐窝深度及黏膜厚度均无异常。此外，通过腌制方法发酵食物的传统自然发酵食品，以其独特清爽、脆嫩风味的口感，能更好地发挥促消化功效[13]。人工接种乳酸菌发酵食品的方法，发酵速度快，总酸含量高，可缩短发酵周期，营养丰富，安全性高，能有效保证产品质量稳定[14]。

综合上述，肥胖和2型糖尿病是常见伴发病，对应的防治策略是控制体重、血糖、血脂，再改善患者胰岛素抵抗，才能带来良好的治疗结局。本研究通过人工接种益生菌发酵工艺，制成益-辣复合发酵剂，对肥胖2型糖尿病小鼠的体重、血糖、血脂、胰岛素抵抗等具有显著的改善效果，而且对小鼠无损伤。传统食品天然辣椒在健康与安全性上具有先天的优势。因此，我们认为益-辣复合发酵剂具有良好的应用价值，值得进一步进行探索其生物作用机制，为其今后作为治疗肥胖及与之伴随的糖尿病的膳食策略奠定了良好的研究基础。