程序性死亡因子-1、程序性死亡配体-1、TNF家族B细胞活化因子-R在弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中的表达

拓进宝，任羽，王丽萍

2延安大学附属医院东关分院检验科，陕西 延安716000

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）约占非霍奇金淋巴瘤的30%～35%，化疗后易复发，是临床难治性肿瘤之一［1-3］。程序性死亡因子-1（programmed death factor-1，PD-1）/程序性死亡配体-1（programmed death-ligand-1，PD-L1）信号通路在肿瘤免疫逃逸中扮演了重要角色，研究表明，通过抑制PD-1/PD-L1 信号通路，可以阻断二者识别而重新恢复T 细胞的免疫功能，因此，阻断PD-1/PD-L1 信号通路这种新思路有望对难治性DLBCL的治疗带来新进展［4-5］。TNF 家族B 细胞活化因子（B cell-activating factor belonging to the TNF family，BAFF）在B 淋巴细胞的生长发育和分化凋亡过程中具有重要作用，其过度表达可破坏自身反应性B 细胞产生及免疫耐受，刺激T细胞活化，增强体液免疫应答。BAFF 的受体BAFF-R 是BAFF 的调控因子，在DLBCL 免疫应答中也扮演了重要角色，是病人临床预后评估的重要实验室指标［6］。目前，国内对PD-1、PD-L1 及BAFF-R 在DLBCL 组织中的差异性表达及潜在免疫治疗价值的研究较少。为此，本研究对28 例DLBCL 组织及瘤旁组织样本进行了免疫组化检测，探讨了PD-1、PD-L1及BAFF-R 在DLBCL 治疗中的临床意义，详细结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料以延安大学附属医院血液科2019年1 月至2020 年4 月初诊的28 例DLBCL 组织及瘤旁组织样本作为研究对象，所有组织样本以石蜡包埋待检。男19 例，女9 例；年龄范围51～81 岁，年龄（68.35±12.57）岁。肿瘤Ann Arbor/Costwards 分期：Ⅰ期5 例，Ⅱ期7 例，Ⅲ期12 例，Ⅳ期4 例。病理分型：ABC 亚型16 例，GCB 亚型12 例。EBV DNA 的PCR 检测：阳性10 例，阴性18 例。国际预后指数（international prognostic index，IPI）评分：0 分4 例，1分5 例，2 分8 例，3 分5 例，4 分4 例，5 分2 例。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤者；（2）术前接受放化疗者。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 免疫组化检测方法组织样本PD-1、PD-L1 及BAFF-R 检测采用EnVison 两步染色法，一抗鼠抗人PD-1 单克隆抗体（MX033）及兔抗人PD-L1 单克隆抗体（MXR003）购自福州迈新公司，二抗PD-1 及PD-L1 为即用型，购自北京中杉金桥公司，BAFF-R抗体购自Proteintech 公司。将组织样本切成4 μm厚切片，置于烤片机中烘烤2～3 h，冷却；常规脱蜡后加柠檬酸盐，置高压锅中行抗原修复，然后用缓冲液冲洗后加二抗，置37 ℃孵育箱中孵育25 min，再以缓冲液冲洗后滴加DAB 显色剂；室温显色满意后以双蒸水冲洗洗掉切片上的DAB；滴加苏木精复染，染色满意后以双蒸水冲洗洗掉切片上的苏木精并放入碱性溶液返蓝；将切片依次放入蒸馏水、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅰ（各2 min）以及二甲苯Ⅱ（10 min）和二甲苯Ⅰ（10 min）脱水，最后中性树脂封片。

1.3 判定标准检测结果采用染色强度评分与阳性细胞计数评分乘积进行判定［7］，染色强度评分标准为阴性0 分、弱阳性1 分、中度阳性2 分、强阳性3分；阳性细胞计数评分标准为无阳性细胞0分、阳性细胞占比1%～10%为1 分、阳性细胞占比11%～50%为2 分，阳性细胞占比≥51%为3 分。两项评分之积即为PD-1、PD-L1 及BAFF-R 的免疫组化评分，≤4 分为低表达，5～9 分为高表达。阳性率=免疫组化阳性数÷总例数。

1.4 统计学方法使用SPSS 22.0 软件进行数据分析，计量资料采用或例（%）表示，所有统计数据采用t检验和χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计意义。

2 结果

2.1 DLBCL组织及瘤旁组织PD-1、PD-L1 及BAFF-R表达DLBCL 组织PD-1、PD-L1及BAFF-R阳性表达积分均显著高于瘤旁组织，相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 淋巴瘤组织及瘤旁组织PD-1、PD-L1及BAFF-R表达水平对比/（分，）

表1 淋巴瘤组织及瘤旁组织PD-1、PD-L1及BAFF-R表达水平对比/（分，）

注：PD-1 为程序性死亡因子-1，PD-L1 为程序性死亡配体-1，BAFF-R为TNF家族B细胞活化因子-R。

2.2 淋巴瘤组织PD-1 表达与临床病理特征的关系淋巴瘤组织PD-1 表达与临床病理特征无相关性（P＞0.05），具体见表2。

表2 淋巴瘤组织PD-1表达与临床病理特征的关系

2.3 淋巴瘤组织PD-L1 表达与临床病理特征的关系不同Ann Arbor/Costwards 分期、病理分型及EBV检测结果间的淋巴瘤组织PD-L1表达情况差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 淋巴瘤组织BAFF-R表达与临床病理特征的关系

2.4 淋巴瘤组织BAFF-R 表达与临床病理特征的关系不同Ann Arbor/Costwards分期、病理分型、IPI评分及EBV 检测结果的淋巴瘤组织BAFF-R 表达情况差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 淋巴瘤组织BAFF-R表达与临床病理特征的关系

3 讨论

随着肿瘤免疫学的不断发展，细胞免疫在肿瘤治疗中的重要作用已为学界所重视。PD-1/PD-L1信号通路的激活则阻断了活化T 细胞的这一重要功能，其不仅抑制T 细胞的正常功能而无法进行抗肿瘤免疫应答，而且还通过抑制T 细胞的免疫应答信号通路而激活肿瘤浸润T 细胞的活性［8］。研究证实［9-10］，PD-1 和PD-L1 在调节免疫应答过程中扮演了重要角色，目前已成为临床重要的免疫检查点之一。在正常情况下，T 细胞被激活后，PD-1 会在活化T 细胞表明迅速表达，与PD-L1 结合并磷酸化PD-1 胞内免疫受体的酪氨酸抑制及转换基序，去磷酸化SHP-1/2 的下游信号分子，导致SHP-1 和SHP-2 募集而抑制PI3K 活性，减少TNF-α、IL-2 及IFN-γ 等细胞因子产生，从而起到抑制T 细胞增殖、维持免疫平衡的作用［11］。PD-1 的配体有PD-L1 和PD-L2 两个，二者相似性高，但PD-L2 分布较为局限，仅在树突状细胞、肥大细胞、巨噬细胞及少量B细胞表明有表达。PD-L1 作为B7 受体家族成员之一PD-1 的配体，主要在T 细胞等抗体递呈细胞中表达，在多种肿瘤组织中均呈高表达，其与PD-1 结合，共同诱导了PD-1 阳性肿瘤相关抗原特异性T细胞的凋亡，是免疫应答过程调节的关键点［12］。PD-1/PD-L1 信号通路激活导致肿瘤免疫逃逸的机制有四：一是干扰T 细胞正常功能而诱导其凋亡，增加肿瘤免疫耐受；二是抑制T 细胞增殖；三是抑制细胞毒性T 淋巴细胞活性；四是抑制IL-2 和IFNγ 等细胞因子产生而促进肿瘤免疫逃逸。Suzuki等［13］研究发现，肿瘤组织PD-L1 高表达能够协助肿瘤细胞逃避化疗所致的细胞凋亡，从而引发化疗药物耐药。弥漫大B 细胞淋巴瘤PD-L1 高表达能够明显促进淋巴瘤细胞增殖，增强淋巴瘤细胞的侵袭能力。本研究结果中，DLBCL 组织PD-1 及PD-L1阳性表达积分均显著高于瘤旁组织，且淋巴瘤组织PD-L1 表达与Ann Arbor/Costwards 分期、病理分型及EBV 感染存在密切关系，但淋巴瘤组织PD-1 表达则与临床病理特征无关。这与Kwon 等［14］和Kataoka 等［15］的研究结论基本一致。综上所述，PD-1/PD-L1 高表达所致的肿瘤免疫逃逸与活化T 细胞功能受抑制有关，故金静霞等［16］认为，PD-1/PD-L1免疫抑制剂可显著提高抗DLBCL 活性。2016 年，美国FDA 批准了Nivolumab PD-1 抗体用于治疗难治性霍奇金淋巴瘤，为淋巴瘤的免疫疗法开启了新篇章［17-18］。

BAFF是TNF家族的重要成员，对调节B细胞生长发育及抗体类型转换、T 细胞活化等具有重要作用。BAFF 高表达与自身反应性B 细胞产生受抑制和自身免疫耐受被破坏有关。BAFF 信号高表达对人体体液免疫应答有重要影响，是引发肿瘤的重要因素。因此，阻断或改变BAFF 信号通路有望成为治疗DLBCL的新方法。本研究结果显示，DLBCL组织BAFF-R 阳性表达积分显著高于瘤旁组织，淋巴瘤组织中BAFF-R表达与Ann Arbor/Costwards 分期、病理分型、IPI 评分及EBV 感染密切相关。曾辉等［19］研究证实，BAFF-R 是DLBCL 预后及靶向治疗的重要判断指标，也是DLBCL 经R-CHOP 化疗后病人预后的独立影响因素。从研究结果来看，PD-1/PD-L1 与BAFF-R 在DLBCL 组织中的高表达存在极高的一致性，且在临床病理特征方面PD-L1 与BAFF-R 表达也存在较好的协调性，故而，二者不仅是DLBCL 重要的治疗靶点，也是价值较高的预后评价指标。

综上，程序性死亡配体-1 及TNF 家族B 细胞活化因子-R 在DLBCL 组织中呈高表达，且与DLBCL分期、病理分型及EBV 感染密切相关，二者联合检测对病人预后评估可能具有较高价值；对难治性DLBCL 而言，以程序性死亡配体-1 及TNF 家族B 细胞活化因子-R 的信号通路为靶点，是潜在的免疫治疗方案。故而，DLBCL 的免疫治疗是今后临床免疫学研究的新方向。