部分水产品中副溶血弧菌的分离鉴定及药敏试验

孔裕琴

摘要：从西宁市5个市场采集鱼、虾各30份样品，通过常规的细菌分离技术分离到副溶血弧菌6株，其平均检出率为10%。药敏试验结果显示分离所得副溶血弧菌对卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明等出现高度敏感;对头孢拉啶、头孢唑啉出现中度敏感;对氨苄西林、青霉素不敏感。

关键词：海产品;副溶血弧菌;分离鉴定;药敏试验

中图分类号：TS201       文献标识码：A

副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus， VP）属于弧菌科，弧菌属，从1950年日本的一次暴发性食物中毒中分离得到此菌[1]。菌体具多形性，可为弧状、杆状或丝状。一端有鞭毛，无芽孢，革兰氏染色为阴性。菌落中等大小，培养24小时直径约为2 mm。嗜盐，可在含7.5% NaCl的培养基上生长最为适宜，在无盐的培养基中生长很差甚至不能生长[2]，在弧菌选择性培养基TCBS琼脂平板上，因该菌不分解蔗糖，所以指示剂不变色，菌落呈现为蓝绿色，这是利用了不发酵蔗糖的原理[3]。副溶血弧菌是普遍存在于海产品中的一种人类和动物共有的病原菌[4]，该菌不仅能给水产养殖业带来巨大的损失，而且会引起水生动物疾病的发生，同时也是引起人类食源性疾病的重要病原菌之一。

为了了解当前市场上销售的海产品中细菌的污染程度，本试验共采集了西宁市市售的部分海产品中的30份鱼样，30份虾样，应用常规细菌分离鉴定技术对副溶血弧菌进行分离与鉴定。以期为今后食源性病原菌的分离培养鉴定提供一定的参考。现将结果报告如下：

1  材料

1.1  样品来源

采集西宁市莫家街市场、朝阳市场、水井巷市场、城南新区市场、八一路市场5个水产市场的鱼样30份，虾样30份（每个市场6份鱼样、6份虾样），共计60份，置于密封袋内，根据来自市场和样品种类的不同分别用字母MJx、MJy、CYx、CYy、SJx、SJy、CNx、CNy、BYx、BYy等标记分开。并带回实验室保存备用。

1.2  培养基

碱性蛋白胨水（BP）;TCBS平板培养基、MH平板培养基。

1.3  药敏纸片

β-内酰胺类：青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、头孢拉啶;氨基糖苷类：庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素;喹诺酮类：萘啶酸、环丙沙星;磺胺类：复方新诺明。购自杭州天和微生物试剂有限公司，批号为910709。

1.4  诊断血清

副溶血弧菌O抗原诊斷血清：副溶血弧菌O抗原的多价诊断血清O1-O13，副溶血弧菌O抗原的单价诊断血清O1-O13。购自天津生物芯片技术有限责任公司。生产批号为20130703。

2  方法

2.1  样品处理及增菌

将每个市场采集的鱼以无菌操作分别从头、背、尾不同部位各剪取2～3 g样品，并剪碎置于装有碱性蛋白胨水的灭菌锥形瓶内。将虾去皮后剪碎，置于装有碱性蛋白胨水的灭菌锥形瓶内。30个灭菌锥形瓶装鱼样（编号分别为MJy1…MJy6，CYy7…CYy12，SJy13…SJy18，CNy19…CNy24，BYy25…BYy30），30个灭菌锥形瓶装虾样（编号分别为MJx1…MJx6，CYx7…CYx12，SJx13…SJx18，CNx19…CNx24，BYx25…BYx30）。共计60个灭菌锥形瓶，置于35℃温箱增菌培养18～24小时。

2.2  分离培养

取增菌液，用接种环勾取1-2环接种到TCBS琼脂平板上（编号为X1，X2，X3…X30;Y1，Y2，Y3…Y30），于35℃温箱中培养18～24小时后观察结果。

2.3  涂片镜检

对培养后的平板仔细观察，并挑取平板上的可疑菌落，然后用接种环勾取单个菌落进行涂片，革兰氏染色，油镜下观察细菌形态并记录结果。

2.4  血清型鉴定

取培养了18～24小时后的培养物，然后用3%食盐水作成比较浓的菌悬液，通过121℃高压1小时或100℃煮沸后，用该菌悬液进行O抗原血清玻片凝集试验，同时选用无菌生理盐水作为对照组，30 s内出现明显凝集者为“阳性”反应，反之为“阴性”反应。同时，以凝集抗原和5 g/L生理盐水混合物作对照。若发生凝集再用副溶血弧菌单价血清逐一做凝集反应，鉴定血清型。

2.5  药敏试验

采用WHO推荐的Kriby-Bauer（K-B）法，判定标准是参照美国实验室标准委员会（NCCLS）药敏纸片扩散法法规进行判定。抗生素药物种类共有10种，环丙沙星、氨苄西林、庆大霉素、妥布霉素、萘啶酸、头孢拉啶、卡那霉素、头孢唑啉、复方新诺明、青霉素。具体方法为：选择编号为X5、X23、Y24、Y29、Y20、Y28共6株菌株进行药敏试验。将分离所得的副溶血弧菌的纯培养物稀释至5×107～5×108 cfu/mL，用灭菌棉拭子将菌液均匀涂布于约4 mm厚的MH平板表面，使平板干燥3～5分钟，然后分别贴上药敏纸片，在35℃温箱培养18～24小后观察测量并记录结果。

3  结果

3.1  菌落特征

经过35℃下培养18～24小时后，在TCBS平板上可见呈圆形，湿润，稍混浊，半透明，中心略隆起，边缘整齐，中等大小的蓝绿色菌落生长。

3.2  涂片镜检

通过细菌培养物涂片、革兰氏染色后，在油镜下观察，可发现分离菌为革兰氏阴性，呈现杆状、丝状或弧状多种形态。

3.3  血清型鉴定

X5、X23、Y24、Y29、Y20、Y28 共6株菌株，其中X5血清型为O4，X23血清型为O6;Y20、Y28分别为O2和O11;Y24、Y29未鉴定出血清型。

3.4  药敏试验

在药敏试验中，所分离到的菌株对环丙沙星、萘啶酸、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明表现出高度敏感， 对头孢拉啶、头孢唑啉出现中度敏感，对氨苄西林、青霉素出現耐药。具体结果见表1。

4  讨论

（1）本试验中共选用60份样品：30份鱼样、30份虾样。经分离鉴定，生化试验，血清型鉴定，药敏试验，最终分离出副溶血弧菌6株，检出率为10%，其中虾的检出率为3.3%，鱼的检出率为6.7%，说明副溶血弧菌在鱼上的携带率较高;城南市场的检出率为5%，八一路市场的检出率为3.3%;莫家街市场的检出率为1.7%，由结果显示城南市场的检出率最高。因此，要引起人们的高度重视，加强食品卫生的管理，严防病从口入。

（2）通过药敏试验，可发现该菌对氨基糖苷类抗生素中的卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素，喹诺酮类抗生素中的萘啶酸、环丙沙星，磺胺类抗生素中的复方新诺明出现高度敏感，对β-内酰胺类抗生素中的氨苄西林、青霉素不敏感，对头孢唑啉、头孢拉啶中度敏感。从现有的研究发现，副溶血弧菌对β-内酰胺类抗生素中的氨苄西林和阿莫西林都产生不同程度的耐药性，就在早期使用的抗生素如第一和第二代头孢菌素类药物都出现高度耐受作用[6]，β-内酰胺类抗生素具有抗菌活性强、毒性低、种类多及适应症广等特性，其抗菌作用机理均为抑制细菌细胞壁的合成。可见，副溶血弧菌的耐药性是十分严重的。

（3）食品安全领域存在的问题主要表现在以下三个方面：①由微生物造成的食源性疾病;②水域的污染、化学性危害、抗生素及重金属等残留;③食品出口受阻、食品安全标准落后于生产和不同企业及不同地区的发展仍然存在巨大的差异，非法生产经营的食品和其他问题。总之，要加强对食品的安全管理，杜绝任何食品的安全问题，形成健康食品、健康生活的社会环境。

参考文献

[1]周正任. 医学微生物学[M]. 第6版. 北京：人民卫生出版社，2006.

[2]陆承平. 兽医微生物学[M]. 北京：中国农业出版社，2011：240-242.

[3]王秀茹. 预防医学微生物学及检验技术[M]. 北京：人民卫生出版社，2002：749-753.

[4]LEE K K. Vibrio parahaemolyticus infectious for both humans and edible mollusk abalone[J]. Microbes Infect，2003，5（4）：481-485.

[5]钟凯，田静，李业鹏，等. 食品中副溶血性弧菌PCR快速检测方法的研究[J]. 中国食品卫生杂志，2004，16（4）：317-320.

[6]江艳华，姚琳，李风铃，等. 青岛市售养殖海水虾中副溶血性弧菌的分离及耐药性分析[J]. 中国人兽共患病学报，2013，29（5）：69-73.