枣树MYB基因家族鉴定、果实表达和盐胁迫响应研究

王军晓，李 婷，马志博，黄 建

(西北农林科技大学 林学院，国家林业和草原局黄土高原林木培育重点实验室，陕西 杨陵 712100)

转录因子是一类调控基因表达的基因，不同的转录因子具有不同的结构域，能特异地与结构基因的启动子区域结合，调控基因的表达[1]。植物的转录因子类型丰富，形成了不同的家族，其中以MYB、WRKY、AP2/ERF等转录因子家族最为庞大。MYB转录因子因N-端含有一段MYB保守结构域被命名，根据含有DNA结合域(DNA-binding domain)的数量被分为不同的亚群，如1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB[2]。MYB家族中的1R类成员参与形态建成、次生代谢及果实发育的过程，R2R3通过参与植物激素合成、信号转导和细胞发育分化等过程响应逆境，3R具有调控细胞周期的作用[3-4]。

MYB家族基因广泛参与了植物的盐胁迫响应、花青素合成、果实发育等过程[5]。近年来，MYB基因家族在经济林果树的果实品质调控和抗逆等方面已经得到深入研究。苹果(Malusdomestica)MYB转录因子MdSIMYB1可以被盐胁迫特异诱导表达[6]，过表达MdoMYB121显著增强了苹果的耐盐性[7]。此外，MYB基因在果实花青素代谢中发挥了重要的调控作用，MdMYB10基因调控苹果花青素代谢和着色[8]，MaMYB2调控葡萄风信子(Muscariarmeniacum)的花青素合成[9]，ZjMYB5参与调控‘胎里红’(ZiziphusjujubaMill.‘Tailihong’)枣果皮前期的红色形成[10]。PbMYB25和PbMYB52参与梨(Pyrusbretschneideri)果实发育过程中木质素的生物合成[11]，DkMYB4基因通过调控柿(Diospyroskaki)果中的单宁影响柿果的涩味[12]。

枣树(Ziziphusjujuba)是我国重要的经济林树种，全国面积约2 000万hm2以上，产值达亿元，成为我国最大的经济林产业之一[13]。枣果具有很高的营养价值，其VC含量丰富，是苹果的近100倍，含糖量约为一般水果的2倍[14]。近年来，新疆枣树栽培面积和产量逐年增长，已经成为枣树主导栽培区，但新疆枣园大多数营造在改造的戈壁滩上，土壤盐渍化严重，是影响枣树生长和生产的主要逆境因素，这就对枣树的抗逆性尤其是耐盐碱能力提出了更高要求[15]，鉴于MYB基因家族在果实品质及抗逆境胁迫中发挥重要的调控作用，有必要对枣树全基因组MYB基因家族鉴定分析，并研究其在果实发育和成熟以及逆境下的表达规律，为阐明枣树果实发育和抗逆的分子机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 枣树MYB转录因子家族成员的鉴定及序列分析

枣树全基因组序列、基因及注释信息下载自枣树基因组(登录号：SAMN 04349627)。首先，根据基因组Interpro(IPR)数据库注释结果，抽取含有MYB结构域的基因，并构建本地数据库。此外，从NCBI下载拟南芥(Arabidopsisthaliana)已注释明确的MYB转录因子序列，以此为query，对枣树基因组基因集进行BlastP(1e-003)分析[16]。对上述鉴定结果进行合并。利用MEGA5.0.2[17]进行多重比较分析(Multi-alignment analysis)(参数默认)，去掉重复序列，对MYB转录因子家族构建进化树，modeltest 确定最佳构树模型(Maximum Likelihood，bootstrap为1 000)，用在线软件EvolView(https://evolgenius.info//evolview-v2/#login)[18]对构建好的进化树进行优化。将MYB氨基酸序列提交至Weblogo(http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi)[19]，获得MYB基因结构域的序列标识，依据其所含DNA结合域的数目对枣树MYB分类。根据骏枣基因组中的MYB基因在染色体上的分布位置信息，利用TBTools(v1.082)[20]绘制基因在染色体上的分布图，参数为默认值。利用MEME Suite 5.3.3(https://meme-suite.org/meme/)[21]，对MYB蛋白进行保守结构域序列分析，基序数量设为10，其余参数为默认值，用TBTools(v1.082)[20]绘制MYB基因基序图，参数为默认值。使用TBTools(v1.082)[20]，对骏枣MYB基因序列绘制基因结构图。

1.2 骏枣果实发育过程中MYB表达分析

基于课题组对骏枣果实盛花期后幼果期(20 d)、膨大期(40 d)、白熟期(60 d)、半红期(80 d)、全红期(100 d)的果肉(中果皮)RNA测序数据，和MYB基因家族的鉴定结果，选取所有MYB成员的表达值(FPKM值)，对骏枣果实发育成熟过程中MYB表达情况聚类并绘制热图[22]。将枣果实着色过程中上调的ZjMYB氨基酸序列与苹果[23-24]、梨[25]、樱桃(Prunusavium)[26]、杨梅(Myricarubra)[27]、紫薯(Ipomoeabatatas)[28]、猕猴桃(Actinidiachinensis)[29]和桃(Amygdaluspersica)[30]的调控花青素或花青苷合成的MYB转录因子氨基酸序列进行比对，系统发育树利用MEGA5.0.2(Neighbor-joining，bootstrap为1 000)进行构建[18]。

1.3 MYB基因家族对盐胁迫的响应分析

根据实验室前期的研究结果，100 mmol·L-1NaCl显著抑制酸枣生长，但仍可以存活，因此研究选用外源添加0 mmol·L-1和100 mmol·L-1的NaCl作为处理[31]。选择7周龄长势一致的酸枣实生苗进行试验，每个处理20盆。在第3天和第8天取样，每个处理3个重复，每个重复3株酸枣幼苗，用于转录组测序分析。筛选所有MYB基因家族成员的表达数据(FPKM值)，对盐胁迫过程中MYB表达情况聚类并绘制热图。将盐胁迫后上调表达的ZjMYB蛋白序列与苹果[4]、小麦[32]中调控盐胁迫的MYB转录因子蛋白序列进行比对，系统发育树利用MEGA5.0.2(Neighbor-joining，bootstrap为1 000)进行构建[18]。

1.4 实时荧光定量qRT-PCR分析ZjMYB的组织差异表达

选择外源添加0 mmol·L-1NaCl和100 mmol·L-1处理3 d的幼苗根、茎和叶，提取RNA。对盐胁迫显著调控的8个MYB基因进行qRT-PCR分析。使用Primer 5.0 软件设计特异性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。利用总RNA提取试剂盒(RE-05021)提取枣树根、茎、叶总RNA，NanoDrop 2 000(thermo scientific)检测RNA纯度。用艾科瑞生物公司试剂盒(AG11706)，进行反转录合成cDNA。荧光定量PCR采用试剂盒(AG11701)，以ZjUBQ基因作为内参基因[33]。PCR反应体系为：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板1 μL，加双蒸水至20 μL。在罗氏LightCycler96上进行荧光定量PCR反应，每个样品进行3次技术重复。用2-ΔΔCT法对数据进行定量分析。对获得数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，显著性分析利用Duncan's，显著性检验水平为5%。

表1 8个MYB基因及其qRT-PCR反应引物设计

2 结果与分析

2.1 枣树MYB转录因子生物信息学分析

2.1.1 枣树MYB转录因子进化分析 根据基因组IPR注释结果，在枣树基因组数据库中鉴定到210个枣树MYB转录因子家族成员，对枣树和拟南芥MYB家族成员的氨基酸序列构建系统发育树。如图1所示，枣树的MYB分别聚类在1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB4个亚群中。

进一步分析ZjMYB蛋白所含DNA结合域的数量，枣树MYB转录因子家族成员可以分为：1R-MYB(72个)、R2R3-MYB(127个)、3R-MYB(9个)、4R-MYB(2个)，与进化分析一致。枣树MYB基因中数量最多的类型是R2R3-MYB类，占总MYB基因的60.48%，1R-MYB类占34.29%，构成了第2大MYB基因群体。

MYB转录因子N-端结构域高度保守，是因其存在大量保守氨基酸，尤其是色氨酸。对MYB保守结构域分析表明，图2A中，在长度约为55个氨基酸的R2结构域中，第10、30、50位的色氨酸(W)残基极保守，这些色氨酸残基之间相互间隔19个氨基酸残基。从图2B可以发现，MYB第2结构基序R3中有2个高度保守的色氨酸残基，这2个色氨酸残基被18个氨基酸残基所隔。

2.1.2 枣树MYB转录因子家族成员分布 将鉴定的MYB基因定位到骏枣基因组中。如图3所示，其中189个基因分别被定位到12条染色体上，21个基因无法定位到染色体上。2号染色体和12号染色体上分布数量最多，均有21个基因，其次是1号染色体上分布有20个基因，4号染色体上的基因最少，只有8个。除此之外，3号和4号染色体上的基因在上臂下臂聚集成簇，10号染色体下臂基因聚集成簇，其他染色体上的基因均匀分布。

2.1.3 枣树MYB转录因子的保守基序预测 利用MEME和TBTools分析了骏枣MYB蛋白的10个基序(Motif)并聚类，得到MYB基因基序图(图4A)。结果表明，Motif 1、Motif 2和Motif 3分布较为广泛，可能发挥着调控枣生长发育过程，ZjMYB110仅有1个基序Motif 1，具有Motif 1的MYB蛋白有100个，具有Motif 2的MYB蛋白有90个，除ZjMYB110、ZjMYB208、ZjMYB210、ZjMYB130、ZjMYB12外，其他MYB蛋白均含Motif 3，同时具有基序1～4的有51个MYB蛋白，7个MYB蛋白具有基序Motif6，6个MYB蛋白具有基序Motif 7或者Motif 9。3R-MYB类转录因子其预测的基序具有较高一致性，且数量较多。

2.1.4 枣树MYB转录因子的基因结构分析 对‘骏枣’MYB基因序列分析，如图4b所示(内含子数量用数字标出)，内含子数从0～13个不等，有93个基因含有内含子数小于等于3，ZjMYB117和ZjMYB94不含内含子。除此之外，不同基因的内含子长度不同，ZjMYB62的内含子最长，而ZjMYB3、ZjMYB60和ZjMYB103这些基因的内含子较短。进化树上距离越近的转录因子，其基因结构的相似程度越大，但也有一些遗传距离较近的基因其内含子的排列方式不同，比如，ZjMYB32含有13个内含子，然而，它的同源基因ZjMYB100却只有2个内含子。总体上，相同的亚群通常包含相同的外显子-内含子剪切模式，如R2R3类成员ZjMYB49、ZjMYB149、ZjMYB167均包含例2个内含子和3 个外显子[34]。

2.2 枣树MYB转录因子在果实发育过程中的表达模式

在骏枣果实转录组数据中，共鉴定到MYB转录因子147个，其中12个MYB在枣果的5个阶段中表达值均小于1。笔者绘制了其余135个MYB的表达量热图并划分了7个类群(Cluster1-Cluster7)，图5A所示。Cluster6(30个)和Cluster7(19个)中的基因在幼果期(a)表达最高，Cluster4(15个)中的基因在膨大期(b)上调比较明显，Cluster2(12个)中的基因在全红期上调比较明显，Cluster1(13个)中的基因在半红期(d)上调比较明显。此外，从MYB表达呈现出白熟期后发生转折。将果实成熟着色过程中上调的25个ZjMYB氨基酸序列与苹果、梨、樱桃、杨梅、紫薯、猕猴桃和桃的调控花青素或花青苷合成的MYB转录因子氨基酸序列进行进化分析。如图5B所示，发现ZjMYB14与苹果MdMYB9和MdMYB11，ZjMYB110与紫薯IBMYB1进化距离最近。

2.3 枣树MYB转录因子对盐胁迫的响应

基于酸枣叶、茎、根的转录组数据，进一步分析了ZjMYB转录因子在盐胁迫下的表达模式，去除所有处理中FPKM值小于1的MYB基因36个，将其余的174个基因绘制表达模式热图(图6A)。结果显示，ZjMYB基因具有明显的组织表达特异性。Cluster4的68个基因主要在叶中高表达，Cluster2和Cluster3分别有34、42个基因在茎中表达量较高，Cluster1(30)与Cluster3(42)中的基因主要在根中差异表达。在叶中，9个MYB基因(ZjMYB175、ZjMYB157、ZjMYB160、ZjMYB69、ZjMYB210、ZjMYB124、ZjMYB19、ZjMYB24、ZjMYB191)在盐胁迫8 d时显著上调；茎中，ZjMYB表达具有时间效应，盐胁迫3 d时，显著上调的有6个MYB基因(ZjMYB106、ZjMYB109、ZjMYB146、ZjMYB159、ZjMYB142、ZjMYB123)，盐胁迫8 d时，上调的有3个基因(ZjMYB168、ZjMYB12、ZjMYB126)；在根中，分别有3个MYB基因(ZjMYB105、ZjMYB118、ZjMYB2)和7个基因(ZjMYB120、ZjMYB93、ZjMYB176、ZjMYB136、ZjMYB14、ZjMYB112、ZjMYB205)在盐胁迫3 d和8 d时差异表达，说明盐胁迫下ZjMYB的表达模式，不仅具有组织表达差异，也具有时间表达差异性。进一步对胁迫3 d时上调的8个MYB基因(表1)，进行qRT-PCR分析(图6b)。结果表明，分别有3、1、2个基因在叶、茎和根中上调表达，这与转录组的数据分析(图7)中的结果基本一致。进一步将盐胁迫上调的28个ZjMYB蛋白序列与苹果、小麦的调控盐胁迫表达的MYB转录因子蛋白序列构建系统发育树(图6c)，发现ZjMYB176与苹果MdoMYB121、ZjMYB112和ZjMYB2与苹果MdSIMYB1、ZjMYB205与小麦TaMYB33聚在同一分支，同源性高。

3 结论与讨论

由于转录因子能够特异性地结合启动子区的顺式作用元件，调控植物生长发育以及抗逆相关基因的表达，因而转录因子在植物生长和环境胁迫时所发挥的关键作用备受关注。随着植物基因组被解析数量的增加,MYB转录因子作为重要的转录因子家族之一，在调控植物细胞发育分化、次生代谢、激素合成和信号转导等过程发挥重要作用[35]。拟南芥[36]、苹果、桃、葡萄、杨树和漆树[37]等植物中均已被鉴定出MYB蛋白，且在基因组或转录组水平上对MYB家族基因进行了深入分析。本研究基于骏枣基因组信息和相关转录组数据的分析，对骏枣MYB转录因子家族结构，表达调控进行分析，为今后MYB转录因子在枣果实成熟，非生物抗逆的研究提供理论依据。

通过对骏枣全基因组的检索与筛选，本研究共鉴定出210个MYB转录因子。与拟南芥的AtMYBs基因家族聚类分析，将其分为了4个亚组中，对其结构域，基因的染色体分布和保守元件分布等进行分析，发现其含有MYB家族典型的DNA结合域，包含110个氨基酸残基，略高于大豆(104个)[38]，漆树(102个)，银杏(102个)[39]。对骏枣果实不同时期的转录数据进行分析后发现，25个ZjMYBs(cluster1，cluster2)表达量随着果实发育的时间增加而上调表达。研究表明，R2R3-MYBs参与了花青素的生物合成途径，如苹果MdR2R3-MYB10基因能异源、同源诱导花青素积累，瞬时检测到色素斑；苹果中鉴定到2个基因MdMYB9、MdMYB11，通过结合MdARN等结构基因的启动上，调控苹果花青苷与原花青素的代谢[40]；葡萄风信子MaR2R3-MYB2基因在花中表达较高，随着花色加深，表达量显著提高；猕猴桃AcR2R3-MYB10基因在果实成熟过程中的表达与花青苷积累过程呈正相关，超表达提高了转基因猕猴桃幼叶中花青苷的积累，而病毒诱导的基因沉默AcR2R3-MYB10后，果实花青苷的积累出现延迟，成熟果实花青苷含量较低[41]。通过与这些基因构建系统发育树发现ZjMYB14和ZjMYB110分别与苹果MdMYB9、MdMYB11和紫薯IBMYB1具有较高同源性，它们可能参与枣果实花青苷的形成，可以作为候选基因进行进一步研究，对于通过经典育种或分子技术育种促进枣果实着色和新品种开发具有重要意义。

苹果中发现，R2R3-MYBs可以响应非生物逆境胁迫，通过异源和同源表达苹果MdoMYB121增强了番茄和苹果对盐胁迫，干旱胁迫，冷胁迫的耐受性；异源和同源表达苹果MdoMYB121发现烟草和‘Gala’苹果植株对NaCl处理的敏感性降低，增强了植物对盐的耐受性；在小麦中也发现了R2R3类MYB基因TaMYB33异位过表达后，通过增强拟南芥渗透平衡重建和ROS清除能力，提高了其对NaCl胁迫的耐受性[42]。本研究对盐胁迫后酸枣转录组数据的分析，鉴定到了4个与苹果MdoMYB121、MdSIMYB1和小麦TaMYB33同源性较高的R2R3类MYB基因：ZjMYB176、ZjMYB112、ZjMYB2和ZjMYB205，主要在根中表达，且在盐胁迫后上调，说明盐胁迫下MYB在提高酸枣抗盐性中可能有重要作用。

本研究结合基因组和转录组数据，对枣中MYB转录因子家族的系统进化关系、染色体定位、基因结构、果实发育不同时期以及盐胁迫下不同组织的表达差异进行分析，初步鉴定了与果实花青素代谢和着色以及调控酸枣抗盐胁迫的ZjMYBs，为深入揭示枣树果实发育成熟、响应逆境过程中MYB转录因子的调控机制奠定了基础。