海南岛橡胶林土壤真菌群落多样性的季节变化特征及其驱动因子分析

魏亚情，吴志祥，杨 川，兰国玉*

(1.中国热带农业科学院 橡胶研究所，海南 海口 571101；2.农业农村部儋州热带作物科学观测试验站，海南 儋州 571737；3.海南大学 生态与环境学院，海南 海口 570228)

海南岛是中国纬度最低、面积最大的热带地区[1]。在过去的20 a里，橡胶种植园在整个东南亚地区迅速发展[2]。目前海南岛的橡胶林分布约占总植被面积1/4[3]。因此，橡胶林已成为中国热带地区，尤其是海南最重要的植被生态系统[4]。土壤微生物在全球生态系统的中扮演着重要的角色，维持着多个生态系统过程的速率和稳定性[5-6]。尽管橡胶种植面积迅速上升，但对土壤微生物群落的影响尚未得到检验[7]。因此，有必要更好地理解环境因素是如何调节地下群落的动态和结构的。

海南岛具有明显的旱雨季变化，其独特的气候条件对土壤微生物群落的影响如何，目前对此方面的研究还尚有欠缺[23-25]。为解答以上问题，本试验采集了海南5个地区旱季和雨季的130份橡胶林土壤样本，使用Illumina Miseq高通量测序技术手段对海南橡胶林旱季和雨季的土壤微生物多样性和群落结构进行了分析，研究结果可为海南橡胶林生态系统的研究提供土壤微生物方面的基础数据,为进一步深入分析橡胶林微生物群落及其生态功能提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域与样本采集

海南岛面积为3.4万km2，属于海洋性热带季风气候，全年温暖湿润，年均温度22～26 ℃；海南雨量充沛，年降水量1 000～2 600 mm，年平均降水量1 639 mm，有明显的多雨季和少雨季。每年的5-10月是多雨季，总降水量达1 500 mm，占全年总降水量的70%～90%；每年11月至翌年4月为少雨季节，仅占全年降水量的10%～30%，橡胶林主要分布在中部山区四周的台地及交通便利，靠近水源地的区域。共选择了5个样地，分别位于海南儋州、琼中、万宁、乐东和海口，在每个样地中随机设置13个重复取样点，旱季和雨季各采样1次，每个点采样2次，分别在2018年1月和7月进行取样，共采集了130份土壤样本。取样步骤：取样时除去地面植被和枯枝落叶，铲除表面1 cm的表土，以避免地面微生物与土样混杂。用直径为4.5 cm的取土钻进行采样取土层0～20 cm，混合均匀后过2 mm筛子后，并按照要求将土样分为3份，前2份带回实验室风干处理或鲜样分析，第3份用于高通量分析。用于高通量分析的土样放入液氮罐中，带回实验室放入-80 ℃的冰箱中保存以待分析。土壤样品采用标准的土壤试验方法进行分析[26-28]。

1.2 DNA抽提和PCR扩增

土壤样本由上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。真菌采用ITS1F_ITS2R引物，引物序列为ITS1F(5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)[29]和ITS2R(5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[30]，扩增程序为95 ℃预变性3 min，27个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min，扩增体系为20 μL，4 μL 5×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 m mol·L-1dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol·L-1)，0.4 μL FastPfu聚合酶，10 ng DNA模板使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物。

1.3 Illumina Miseq测序

利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(AxygenBiosciences，Union City，CA，USA)进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)进行定量。根据Illumina MiSeq平台(Illumina，SanDiego，USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE(2×250)的文库。

1.4 数据分析

使用FLASH软件对原始数据序列进行筛选优化，对优化序列提取非重复序列，按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，得到相似性在97%以上的有效序列[30]。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库(SSU128)，设置比对阈值为70%，利用mothur计算不同随机抽样下的α多样性指数[31]。基于Bray-Curtis距离，进行主坐标分析(PCoA)，揭示了2个季节微生物群落结构相似性，用相似性分析(ANOSIM)分析季节对橡胶林土壤真菌群落结构的季节差异。采用冗余分析(RDA)来揭示微生物群落与环境因子之间的相关性，计算在R的“Vegan”包中进行。

2 结果与分析

2.1 真菌群落组成

对海南岛橡胶林不同季节的土壤样本进行高通量测序，共检测到真菌9门、37纲、115目、289科、818属，图1展示了旱季和雨季土壤样本在门和纲分类水平上的真菌群落组成。菌群门水平上，优势菌门依次为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和接合菌门(Zygomycota)，各优势菌门中，子囊菌门的相对丰度在雨季时显著大于旱季(P<0.01，图1)。在菌群纲水平上，优势菌纲依次是未分类真菌、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、伞菌纲(Agaricomycetes)、未分类子囊菌门(unclassified_P_Ascomycota)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、norank_P_Zygomycota、norank_P_Ascomycota、古根菌纲(Archaeorhizomycetes)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)，其中未分类子囊菌门的相对丰度在雨季时显著大于旱季(P<0.01)。

用PCoA(主坐标分析，基于Bray-Curtis距离)排序分析方法对群落组成进行可视化(图2)，相似性分析(ANOSIM)结果表明，旱季和雨季土壤样本间群落组成差异显著(R=0.051，P=0.001)。通过置换多因素方差分析(PERMANOVA)分析不同分组对样品差异的解释度，结果表明，季节变化仅能解释真菌群落组成差异的1.7%(R2=0.017，P=0.001)。

2.2 微生物群落多样性

α多样性分析反映微生物群落的丰富度和多样性，从ACE指数、Chao 1指数和Shannon指数、Simpson指数分析来看，雨季橡胶林土壤真菌ACE指数、Chao 1指数和Shannon指数显著高于旱季(P<0.05)，Simpson指数低于旱季(表1)。

表1 不同季节橡胶林土壤真菌多样性指数

2.3 群落多样性与环境因子相关性

通过线性回归分析可知，真菌α多样性与pH，有机质(SOM)，有效P(AP)，有效K(AK)，全N(TN)，温度(Tem)呈显著正相关(pH:R2=0.19，P<0.001；SOM:R2=0.06，P=0.005；AP:R2=0.08，P=0.001；AK:R2=0.06，P=0.004；TN:R2=0.13，P<0.001；Tem:R2=0.14，P<0.001)，所有的环境因子中，pH、全N和温度是影响土壤真菌多样性的主要环境因(图3)。

RDA分析结果表明，环境因子中温度(Tem)、全氮(TN)、有机质(SOM)、降雨量(Pre)、pH是真菌群落β多样性的主要影响因子(图4)，分别解释了真菌群落组成的8.90%、5.42%、4.73%、4.32%、4.29%(表2)。Spearman相关性分析结果表明，大多数真菌门与有机质、pH、全N、降雨量、温度有显著相关性，与RDA分析结果一致(图5)。

表2 环境因子对微生物群落的解释度

3 结论与讨论

本研究采用高通量测序方法对橡胶林土壤真菌群落组成和多样性进行了研究，结果表明，子囊菌门、担子菌门和子囊菌纲、伞菌纲分别是真菌群落在门水平和纲水平相对丰度最高的类群。此前研究报道，全球采样尺度上，子囊菌门和担子菌门是土壤真菌群落的优势菌门，子囊菌纲和伞菌纲是真菌群落的优势类群，与本研究结果一致[13]。

季节变化反映了土壤温度和湿度的变化[32]，土壤微生物群落的多样性受土壤含水量(WC)驱动[8,13]，然而，本研究结果表明，WC和真菌多样性之间并无显著的相关关系，这是因为土壤水分含量会间接影响微生物活性，高含水量会导致氧气供应不足从而降低有机质分解速率，而土壤水分含量低则会降低可溶基质的扩散和微生物的迁移能力，从而降低微生物的活性[33-34]。pH与土壤真菌的多样性显著正相关，是橡胶林真菌多样性最主要的驱动因子，此结果与近几年的研究结果一致[15,35]。RDA分析结果表明，环境因子中，温度是真菌群落组成最主要的驱动因子，Wang等[36]研究发现，微生物多样性与温度正相关，呈现出纬度梯度的多样性，本研究结果与之一致，而Bahram等[12]的研究结果表明土壤细菌的多样性从中纬度向两极和赤道递减。不同研究结果之间存在差异，一方面是因为研究的地理尺度格局和采样数量的差异，另一方面是因为相比于自然生态系统橡胶林生态系统有其独特的生存环境以及微生物生活史的不同[37]。