基于网络药理学探讨参蛭通心胶囊治疗室性早搏的作用机制

齐璐瑶，邢基祥，范吉林，侯信铮，张世亮

(1. 山东中医药大学，山东 济南 250014；2. 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)

室性早搏(premature ventricular beats，PVBs)是指窦房结发出的激动未抵达之前，心室其他起搏点提早兴奋，使心室发生除极化过程，属于心律失常的范畴[1]。其症状多表现为心悸、“停搏”感、胸闷、摸脉时有间歇，也可见无异常表现者。若早搏较少则不需要特殊处理，心悸产生焦虑时可予以一定的安抚或治疗；若发生多源性室性早搏或短阵室速明显影响心排血量时，症状更加显著，则需规范治疗。常见的病因有冠状动脉粥样硬化性心脏病等器质性心脏病、自主神经功能紊乱、左室内假腱索、电解质失衡以及药物等。本病临床常见，据统计75岁以上人群中发病率达69%[2]。西药治疗本病时常有致心律失常的局限性。参蛭通心胶囊是笔者导师张世亮依据多年诊疗经验创立的治疗气虚血瘀型室性早搏的代表方，主要由人参、水蛭、三七、丹参、川芎、麦冬、冰片七味药材配伍而成，临床试验证实其在改善普通心电图和24 h动态心电图方面有效率(72.4%)远高于长效倍他乐克(44.8%)，室性早搏的削减数量非常可观[3]。长期的临床观察发现该药疗效确切，不但能显著减少室性早搏发作的频次和缩短每次持续的时间，而且对靶器官也有一定的保护效果[3-4]。网络药理学是运用药物与系统生物学相结合的形式，分析药物与疾病、靶点之间存在的复杂多样的协同作用关系[5]，其借助大数据平台系统、综合的特点，推动整体、辨证的中医药事业发展的过程。本研究基于网络药理学技术，旨在解析参蛭通心胶囊治疗室性早搏的作用机制。

1 资料与方法

1.1参蛭通心胶囊有效成分与靶点的获取 参蛭通心胶囊各种有效成分的收集来源于TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库。对于TCMSP收录的人参、三七、丹参、川芎、冰片等，设定口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18，得到其潜在有效成分，进而预测其作用靶点；对于TCMSP未收录的水蛭、麦冬等药物，可通过BATMAN-TCM查找其活性成分，进而预测其相关靶点。而后把参蛭通心胶囊得到的所有潜在靶点统一导入Uniprot(https://www.uniprot.org/) 数据库，进一步规范地处理基因。

1.2室性早搏已知靶点的获取 在GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库中，检索关键词“premature ventricular beats”，将获得的数据导入 Uniprot数据库进行标准化处理，进而获得室性早搏在人体内的靶基因。

1.3参蛭通心胶囊治疗室性早搏靶点的获取 运用Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)平台，将参蛭通心胶囊潜在靶点与室性早搏已知靶点导入，图形重叠区域就是参蛭通心胶囊治疗室性早搏的潜在作用靶点。

1.4“参蛭通心胶囊-成分-室性早搏-靶点”网络图的构建 将参蛭通心胶囊所含活性成分与药物-室性早搏的共同靶点一同导入Cytoscape3.7.2软件，构建“参蛭通心胶囊-成分-室性早搏-靶点”关系网络。

1.5疾病-药物蛋白互作(PPI)可视化网络图与核心靶点图的制作 在STRING(https://string-db.org)数据库中导入参蛭通心胶囊-室性早搏的交集靶点，限制物种为“人”(Homo sapiens)，规定交互分数最低值>0.4，由此建立PPI网络图。向Cytoscape3.7.2中导入结果，选取大于平均Degree值的靶点建立核心靶点图。

1.6GO功能与KEGG通路富集分析 利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov)数据库，将整合的交集靶点导入，以“PValue、FDR均<0.05”为前提筛选，获取参蛭通心胶囊治疗室性早搏的GO分析结果。而后，将筛选获取的数据导入微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平台，制作BP、CC、MF三合一柱状图。同时运用R语言软件，将gene symbol对应的id导入运行，得到KEGG通路富集分析的气泡图和主要通路的作用路径示意图，推测参蛭通心胶囊治疗室性早搏的作用机制。

1.7参蛭通心胶囊治疗室性早搏的核心靶点及主要成分的分子对接 依据核心靶点图选取出较为关键的核心靶点，找到这些核心靶点对应参蛭通心胶囊的主要成分，而后一一进行验证。在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)网站检索所需小分子配体的二维结构，利用Chem3D将其转化为三维结构。在PDB(https://www.rcsb.org/)网站搜索大分子受体的3D模型，运用PyMOL去水、去小分子。利用AutoDockTools生成小分子配体和大分子受体的最终格式。运用命令提示符的命令计算出两者一一对应的结合能。而后选取结合能最小的六对，在PyMOL软件中进行分子对接。

2 结 果

2.1参蛭通心胶囊有效成分筛选结果 利用TCMSP、BATMAN-TCM数据库检索参蛭通心胶囊的7种中药组成，通过OB≥30%，DL≥0.18或删除重复项等步骤进行整合，筛选得到人参22个、冰片3个、川芎7个、丹参65个、三七8个、水蛭13个、麦冬18个，共计136个潜在有效成分，见表1及表2。

表1 TCMSP人参、冰片、川芎、丹参、三七的活性成分

续表

续表

表2 BATMAN-TCM水蛭、麦冬的活性成分

2.2参蛭通心胶囊治疗室性早搏靶点的获取 参蛭通心胶囊的136个潜在有效成分共对应到人类相关基因靶点630个，同时，室性早搏的靶点共有1 189个，利用Venn图得到参蛭通心胶囊与室性早搏的共同靶点193个，即为参蛭通心胶囊治疗室性早搏的靶点，见图1。

2.3参蛭通心胶囊有效成分及与药物-室性早搏对应靶点网络图的构建 Cytoscape3.7.2软件可构建“参蛭通心胶囊-成分-室性早搏-靶点图”，见图 2。在图中，周围各色的扁圆形表示参蛭通心胶囊涵盖的各种成分，中央的长方形表示靶点基因，菱形代表参蛭通心胶囊的7种中药组成和室性早搏的名称；若有成分或靶点重复者则仅显示一次。由图可见各药物、成分、疾病、靶点之间错综复杂而又密切的联系。

图1 参蛭通心胶囊-室性早搏药物-疾病交集靶点Venn图

2.4PPI网络图及核心靶点图的制作 STRING数据库可以获取参蛭通心胶囊-室性早搏的PPI网络图，规定交互分数最低值>0.4，隐藏游离节点，其余设定均为默认值，结果见图3。图中共有193个节点、2 611条边，Degree的平均值为27.1。可见参与此过程的蛋白质之多与蛋白质之间作用的复杂性、多样性。为了创建明确的核心靶点图，将STRING的结果导入Cytoscape3.7.2软件中进行拓扑分析。在平均Degree为27.1的情况下，以Degree大于28为条件筛选核心靶点，得出核心靶点图，见图 4。图中圆越大代表Degree值越高，则越有可能是参蛭通心胶囊治疗室性早搏的核心作用靶点。这些核心靶点主要有INS、ALB、IL6、AKT1、VEGFA、TNF、NOS3等。

2.5GO功能与KEGG通路富集分析 利用DAVID数据库对参蛭通心胶囊与室性早搏的共同靶点做GO富集分析。GO分析主要包括BP-生物学过程，CC-细胞定位和MF-分子功能分析。三者均以“PValue、FDR均<0.05”为条件筛选后，各选取富集基因数最多的前9条结果，利用微生信平台，制作BP，CC，MF三合一柱状图，则可直观展现GO分析的各项结果，见图 5。KEGG通路富集分析通过R语言运行得出气泡图，见图6。信号通路主要包括Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、cAMP signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、MAPK signaling pathway等。选取靶点富集数目较多且核心靶点富集的、qvalue值较小的3个路径绘制示意图，见图7～9。

2.6参蛭通心胶囊治疗室性早搏的核心靶点及主要成分的分子对接结果 关键的核心靶点、与主要化合物成分的对应关系以及相应的结合能见表3。当结合能<-5.0 kcal/mol时[6]，配体与受体结合相对稳定，随着结合能减小，结合性会更好。选取表3中结合能最小的6组配体与受体绘制分子对接示意图，见图10。

图2 参蛭通心胶囊-室性早搏药物-成分-疾病-靶点网络图

图3 参蛭通心胶囊-室性早搏药物-疾病交集靶点互作PPI网络图

3 讨 论

室性早搏可归类于中医学中“心悸”“怔忡”，古籍中早有关于其证候的描述，如《内经》中提到“参伍不调者病”以及“予之短期者，乍数乍疏也”等。综合历代医家经验，此病多属本虚标实，虚实夹杂，为脏腑气血阴阳亏虚的基础上兼夹痰、瘀、火等实邪，使得心神失宁，心脉不畅，心之气血阴阳不相顺接而致“脉结代，心动悸”之象。人参、麦冬可益气养血，养阴生津，针对本虚；水蛭、三七、丹参、川芎可活血通脉，冰片化火祛瘀，针对标实，共奏补虚损、祛实邪之功。

现代药理研究发现，参蛭通心胶囊的7味药材大都具有调节神经中枢与免疫功能、保护心脑血管系统等靶器官、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、镇静止痛、促进代谢等功效[7-10]。人参皂苷Re、Rb1调节Cx43蛋白的表达，起到抗心律失常的作用[11]。丹参的主要成分丹参酮ⅡA可以调节细胞离子通道，不仅可以抗心律失常，而且可减少心肌缺血再灌注性心律失常的发生，提高心率变异性[12-14]。现代研究证实人参与丹参发挥抗心律失常作用均与抑制电压依赖性Na+通道和主要K+通道的电流有关[15-16]。辛丽等[17]发现，“主心气不足, 惊悸怔忡”的麦冬中的麦冬皂苷可迅速将失常的心律转为正常窦性心律。麦冬和丹参作为抑制心律失常的药物，在调研的149 项心律失常中药疗效验方专利中应用比例过半[18]。

图4 参蛭通心胶囊-室性早搏药物-疾病核心靶点网络图

图5 参蛭通心胶囊-室性早搏富集GO term BP，CC，MF三合一柱状图

图6 参蛭通心胶囊-室性早搏KEGG通路富集分析气泡图

水蛭抗心律失常的机制可能与抑制凝血酶、改善血管内皮功能等改善心肌灌注有关[19]。心肌灌注不充分有时会造成电解质紊乱、心肌代谢或神经系统失衡, 造成电稳定性波动, 影响心肌的自律性和兴奋性[20]。三七的主要成分三七总皂甙能明显减少大鼠冠脉结扎早期各种室性心律失常的持续时间,抑制高钾诱发的Ca2+浓度上升[21]。三七粉联合长效倍他乐克治疗室早，可明显减少倍他乐克用量，还可降低不良事件发生率[22]。川芎在临床中被证实能增效减毒，减少心律失常的复发，对中度及顽固性心律失常疗效显著。其主要机制可能与川芎嗪、阿魏酸减慢心率，改善冠脉供血与心肌代谢和明显的中枢镇静作用有关[10]。吴伟曾用川芎治疗1例心悸病的疑难杂症[23]。冰片与大剂量麝香配伍能提高心搏骤停心肺复苏后脑复苏成功率，并可加速疾病恢复，改善预后[24]，降低心律失常所致猝死的风险。

图8 参蛭通心胶囊-室性早搏cAMP signaling pathway路径示意图

图9 参蛭通心胶囊-室性早搏MAPK signaling pathway路径示意图

由核心靶点图、GO和KEGG分析可以得出，参蛭通心胶囊治疗室性早搏主要是通过质膜位置的蛋白质结合和信号传导等过程完成的，而主要的靶点有INS、ALB、IL6、AKT1、VEGFA、TNF、NOS3等，主要的信号转导通路包括Calcium signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、cAMP signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、MAPK signaling pathway等。由主要信号通路的路径示意图可以得出，INS主要通过cGMP-PKG signaling pathway发挥作用，TNF主要通过MAPK signaling pathway发挥作用，NOS主要通过Calcium signaling pathway发挥作用。研究表明，INS是由胰岛β细胞释放的体内唯一一种降糖类蛋白质激素，其峰值增高与左室肥厚具相关性[25]。cGMP-PKG signaling pathway介导双向调节血管平滑肌，对抗心脏肥大、动脉粥样硬化和血管损伤或再狭窄后损伤等多个过程[26]。通过上调心肌细胞cGMP-PKG signaling pathway的利钠肽受体A、鸟苷酸环化酶、内皮型一氧化氮合酶，使cGMP表达增多；下调磷酸二酯酶5A，减少cGMP降解，两方面促进cGMP的持续作用，阻止心肌肥厚进展，显著提高射血分数保留性心衰大鼠的心肌顺应程度[27]。可见，INS可能通过作用于cGMP-PKG通路，抗心肌肥厚，保护心脏结构，预防和治疗室性早搏。室性早搏患者血清中的TNF-α、IL-6较健康人群的正常水平均有不同程度的波动[28]。冯丹等[29]研究结果表明，降低TNF-α、CRP，减轻机体炎症反应，可有效减少室性早搏的发生，提示炎症反应可能是诱发室性早搏及疾病顽固性的原因之一[30]。IL-6作为心血管事件发生的重要危险因素和预测因子、数种免疫疾病的诱因，在多篇研究中作为独立研究因素探讨，与心脏病的发生密不可分，会引起心肌纤维化、心肌重构等指标的改变，进而改变离子通道[31]。接受IL免疫治疗时有14%～21%的概率会引起心律失常[32]。因此，抗炎治疗在抑制心肌纤维化，调节自主神经活动[33]，扭转心律失常方面存在显著效果。MAPK signaling pathway的抑制能为减轻炎症反应提供贡献，还能减少细胞凋亡，减轻脂多糖诱导的心肌损伤以及室性心律失常等[34]。可见，TNF可能通过作用于MAPK通路，对抗炎症反应，达到抗心律失常的作用。NOS3属于NOS家族，NOS在体内催化产生NO，可调控从心肌细胞兴奋-收缩耦联到相关的信号调节等过程。NOS若失耦联，Ca2+循环则会失调,造成细胞内Ca2+超载、心肌代谢障碍等改变，最终导致心律失常、心力衰竭甚至心源性猝死。NOS3、RYR2可抑制细胞凋亡、改善内皮功能、维持心肌Ca2+稳态，进而抑制房颤的发生发展[35]。Calcium signaling pathway分布且作用广泛，Ca2+参与神经信息的传导与神经细胞的老化、肌肉收缩和细胞形态的改变、腺体细胞的分泌等多个过程。心脏兴奋-收缩耦联同样也离不开Ca2+，钙稳态对心肌结构和功能的调节有不可或缺的影响，Ca2+的异常会造成心肌肥大或收缩障碍等[36]。由此得出，NOS3可能通过作用于Calcium signaling pathway，通过Ca2+的转运及调节，影响各离子通道系统，调控心脏的自主神经功能，避免心律失常的产生。进一步分析发现，上述核心靶点和信号通路通过参与调控细胞凋亡、抑制炎性反应、免疫调节、恢复心脏血流、清除自由基等一系列环节使室性早搏的症状得以缓解。分子对接结果表明藏红花酸(Crocetin)、槲皮素(quercetin)、木樨草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、豆甾醇(Stigmasterol)等活性成分与靶蛋白INS、IL6、VEGFA、NOS3等具有很好的对接活性，提示参蛭通心胶囊活性成分与靶蛋白稳定结合，以此发挥治疗室性早搏的效果。

表3 参蛭通心胶囊治疗室性早搏的核心靶点及对应主要成分的分子对接结果

图10 参蛭通心胶囊-室性早搏配体与受体分子对接示意图

本文通过网络药理学和分子对接的途径揭示了参蛭通心胶囊对室性早搏的治疗作用，可能是通过以槲皮素等为代表的多成分，INS、IL6、NOS3等多个靶点，调控Calcium signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、MAPK signaling pathway在内的多个信号通路，发挥调节人体免疫、抑制炎性反应及对抗氧化应激等过程来实现的。但本研究仍存在一定的进步空间，网络药理学数据库未考虑剂型等的影响作用，参蛭通心胶囊作为胶囊包裹的颗粒剂型对发挥药效的影响未考虑入内，同样，室性早搏的发生机制也需要更加深入的探索。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。