骨改建中miR-134-5p通过靶向Itgb1抑制小鼠破骨细胞形成的研究

黄 萌，江小霞，崔建通，赵长铭，王振宁，张 宇，吴丽丽，孙兆峰，徐璐璐 解放军总医院研究生院，北京 0085； 解放军总医院第一医学中心 口腔正畸科，北京 0085； 军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所，北京 0009

骨改建是维持骨骼正常结构的重要过程。在骨微环境中，破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞的骨生成相互平衡，共同维持骨的基本结构稳定。而外伤、激素水平等因素的刺激会引起骨改建微环境的变化，可能会导致破骨细胞异常激活，从而导致骨组织出现不必要的吸收、溶解，影响骨结构的稳态[1]。因此，探究骨改建时影响破骨细胞的因素及其机制尤为重要。微RNA(microRNA，miRNA)作为转录后基因表达的调控因子，是一种长度约 22 nt的内源性非编码RNA[2]。研究表明多种miRNA在破骨细胞生成过程中起着不可忽视的作用[3-4]。它们通过调控靶基因从而改变骨稳态，使骨微环境向骨形成或骨吸收方向进展[5-7]。在大鼠平滑肌中miR-134-5p过表达可以促进钙沉积，而这也是成骨作用开始发生的表现[8]。然而，miR-134-5p对骨吸收调控的相关机制尚未见报道。因此本研究旨在探讨miR-134-5p在破骨细胞分化中发挥的作用及其可能的机制，进一步阐明miR-134-5p在骨改建过程中的作用机制。

材料与方法

1 实验动物 6 ~ 8 周龄 SPF 级 C57BL/6 雄性小鼠购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。动物实验经军事科学院军事医学研究院伦理委员会审核并予以批准(IACUC-DWZX-2020-729)。

2 主要试剂和材料 α-MEM 培养基 (Gibco，美国)；特级胎牛血清FBS(Gibco，美国)；磷酸缓冲盐溶液PBS(Gibco，美国)；青霉素/链霉素双抗(Gibco，美国)；核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor κ B ligand，RANKL)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF；Peprotech，美国)；转染试剂 LipofectamineTM2000 试剂盒 (Invitrogen，美国)；mRNA引物、miR-134-5p引物、miR-134-5p 过表达模拟物 miR-134-5p agomir、敲低模拟物miR-134-5p antagomir及相应阴性对照(agomir NC 和 antagomir NC；生工生物工程股份有限公司，中国)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartaric acidic phosphatase，TRAP) 试剂盒 (Sigma aldrich，美国)；Trizol(Invitrogen，美国)；SYBR Green 荧光定量 PCR 检测试剂盒、PrimeScript RT reagent kit反转录试剂盒(Takara，日本)；4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100 鬼笔环肽、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；上海碧云天)；RIPA缓冲液(Sigma，美国)；BCA 试 剂 盒 (Thermo Fisher Scientific，USA)；兔抗鼠GAPDH 、兔抗鼠TRAP抗体、兔抗鼠CTSK、兔抗鼠NFATc1和兔抗鼠Itgb1抗体(Affinity Biosciences，USA)；羊抗兔二抗 (中杉金桥)；ECL发光液(普利莱)。

3 小鼠骨髓来源巨噬细胞的分离和培养 6 ~ 8周龄的C57BL/6雄性小鼠采用颈椎脱臼法处死，浸没于75%乙醇中。在无菌条件下分离小鼠下肢皮肤，暴露胫骨、股骨，剔除肌肉、筋膜等软组织，用含双抗的PBS冲洗股骨和胫骨，随后剪去干骺端，使用1 mL无菌注射器吸取无血清α-MEM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔内无血块为止。将含有骨髓细胞的无血清α-MEM培养基转移至15 mL离心管中，移液器将细胞吹打混匀，1 000 r/min 离心 5 min 后弃去上清，用含 10%FBS的α-MEM完全培养基重悬细胞，接种于T25培养瓶中，在温度为37℃、5% CO2培养箱中培养 6 ~ 8 h。收集培养瓶中未贴壁的细胞，即为小鼠骨髓来源的巨噬细胞 (bone marrow monocytes，BMMs)。1 000 r/min 离心 5 min 后弃去上清，用含10% FBS的α-MEM完全培养基重悬细胞，计数，然后进行后续相关实验。

4 骨髓来源巨噬细胞的诱导分化 将 BMMs 以5×105/孔接种于 24 孔板中，用含 30 ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANKL的α-MEM完全培养基培养，每2 d换液，诱导7 d后进行相应检测。将提取的原代BMMs以1×104/孔接种于96孔板中，细胞诱导至7 d时，根据TRAP染色试剂盒说明书对诱导的细胞进行TRAP染色：移除培养液，用PBS洗3遍，每次5 min。4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS洗3遍，每次 5 min，使用TRAP染色液37℃孵育1 h后终止染色，在倒置相差显微镜下观察并拍照，记录每个孔中TRAP阳性且细胞核数目≥3的破骨细胞数目。

5 细胞分组及转染 实验分为过表达 miR-134-5p(agomir)组、敲低 miR-134-5p (antagomir)组及其 相应对照组 (agomir NC 和 antagomir NC)。 将BMMs细胞以1×106/孔种于12孔板中，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，使用LipofectamineTM2000 将 agomir、antagomir及其相应对照 agomir NC、antagomir NC 分别转染入 BMMs中，在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后更换含 30 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的 α-MEM培养基继续诱导培养7 d。按照TRAP染色试剂盒说明书对细胞进行TRAP染色(方法同前)，检测转染后各组形成的破骨细胞数目。

6 肌动蛋白环 (F-actin)染色 为检测诱导后形成的破骨细胞中肌动蛋白环数目，将提取的原代BMMs以1×104/孔接种于96孔板中，细胞按照分组诱导至7 d时，PBS清洗BMMs诱导的破骨细胞3次，4%多聚甲醛冰上固定15 min，PBS清洗细胞3次；用含0.5% Triton X-100的PBS室温透化细胞10 min，PBS清洗细胞3次；加入鬼笔环肽染色液，在室温避光孵育20 min，进行染色；PBS清洗细胞3次，加入DAPI染色液复染10 min，吸去染色液，PBS 清洗细胞3次；吸去多余水分，封片，荧光显微镜观察纤维状肌动蛋白(F-actin)。经标记后细胞呈红色空泡状，含有3个或3个以上DAPI蓝染细胞核的阳性细胞即为破骨细胞。

7 RNA 提取及 qRT-PCR 使用 Trizol提取细胞中的总RNA，按照mRNA和miRNA反转录试剂盒说明书，分别对总RNA进行反转录合成cDNA，采用SYBR Green荧光定量PCR检测试剂盒或miRNA荧光定量PCR试剂盒进行检测。实时定量PCR以β-actin为内参，检测破骨相关因子的表达；以U6作为内参，用miRNA荧光定量PCR试剂盒检测miR-134-5p的相对表达量，引物序列见表1，结果以2-ΔΔCt表示，实验重复3次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

8 预 测 miR-134-5p 靶 基 因 通 过 靶 基 因 数 据库TargetScan(http://www.targetscan.org)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)以及miRDB(http://mirdb.org)在线预测 miR-134-5p 的靶基因结果，绘制韦恩图，得到交集靶基因。

9 检测靶基因和蛋白表达量 收集诱导后的破骨细胞，分别通过qRT-PCR(实验步骤同上文“7 RNA 提取及 qRT-PCR”)和 Western blot检测转染后各组Itgb1基因和蛋白表达量。

10 Western blot检测 Western blot检测收集转染后的破骨细胞，用PBS清洗2遍，加入细胞裂解液RIPA裂解细胞。按照BCA试剂盒的说明，测定蛋白含量后，制备10% SDS-PAGE的凝胶取定量的总蛋白量进行电泳，PVDF转膜，室温下5%脱脂牛奶封闭 1 h，一抗TRAP、CTSK和NFATc1按照1∶1 000的浓度配制后4℃孵育过夜；次日TBST洗3次，每次10 min，加入二抗室温孵育1 h后，TBST洗3次，ECL发光液显色。使用 Image J 软件对 Western blot条带进行分析。

11 统计与分析 采用 Graphpad Prism 7 软件进行统计学分析。数据以3次独立重复实验的±s表示，两组间样本均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间样本比较采用Dunnett-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 BMMs 分离培养和诱导分化情况 小鼠 BMMs在含有 30 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 培养基的诱导下，在7 ~ 10 d内发生细胞融合，形成多核巨细胞。通过TRAP染色方法，发现与诱导1 d的BMMs细胞相比，诱导7 d后的BMMs细胞可形成大量多核巨细胞，且两组有统计学差异(P＜0.001；图1)。对形成的破骨细胞进行实时定量PCR检测，发现在破骨诱导过程中破骨相关基因TRAP、CTSK和NFATc1表达升高(图2A~C)，而破骨细胞中miR-134-5p的表达降低(P＜0.05；图2D)，提示破骨诱导成功，且miR-134-5p在破骨细胞中发挥抑制作用。

图1 BMMs破骨诱导分化7 d后的TRAP染色A：破骨诱导1 d后的TRAP染色；B：破骨诱导7 d后的TRAP染色；C：对形成破骨细胞进行定量分析Fig.1 TRAP staining after the BMMs was induced for 7 days A: TRAP staining after the BMMs was induced for 1 day; B: TRAP staining after the BMMs was induced for 7 days; C: quantitative analysis of the formation of osteoclasts

图2 BMMs破骨诱导分化7 d后的破骨相关基因TRAP (A)、CTSK (B)、NFATc1(C)及miR-134-5p (D)的表达Fig.2 Expression levels of osteoclast-related genes TRAP (A), CTSK (B), NFATc1(C) and miR-134-5p after the BMMs was induced for 7 days

2 miR-134-5p 过表达和敲低模拟物转染效率的验证 BMMs转染miR-134-5p过表达和敲低模拟物及其相应阴性对照48 h后，通过qRT-PCR检测其转染效率。与各自阴性对照组相比，miR-134-5p过表达组(转染agomir组)破骨细胞中miR-134-5p表达显著升高(P＜0.001)，而在miR-134-5p敲低组(转染antagomir组)显著降低(P＜0.05；图3)，表明细胞成功实现miR-134-5p过表达或敲低。

图3 miR-134-5p过表达物agomir、敲低物antagomir及其相应对照的转染效率 A：转染agomir后检测其转染效率；B：转染antagomir后检测其转染效率Fig.3 Transfection efficiency of miR-134-5p A: transfection efficiency after agomir was transfected into the BMMs;B: transfection efficiency after antagomir was transfected into the BMMs

3 miR-134-5p 抑制破骨细胞的形成 对进行转染的细胞进行TRAP染色对破骨细胞数目进行计量，并且进行肌动蛋白环(F-actin)染色，同时通过qRT-PCR检测破骨相关基因。结果显示，转染agomir后，TRAP染色示agomir组中TRAP染色阳性的多核巨细胞数较对照组显著减少(P＜0.01)；而转染antagomir后，antagomir组中TRAP染色阳性的多核巨细胞数较对照组明显增加(P＜0.01；图4)。通过F-actin免疫荧光检测肌动蛋白环数目，并对其进行统计分析，也显示了同样的结果——转染agomir后肌动蛋白环的形成数目显著减少，而转染antagomir后肌动蛋白环形成数目明显增多(P＜0.01；图5)。同时，通过qRT-PCR检测破骨分化相关基因TRAP、CTSK和NFATc1，转染agomir后破骨分化相关基因的表达明显低于对照组，相反，转染antagomir后破骨分化相关基因表达较对照组升高(P＜0.001；图6)。上述结果提示miR-134-5p可显著抑制破骨细胞生成。

图4 miR-134-5p过表达(转染agomir)抑制破骨细胞形成，敲低(转染antagomir)促进破骨细胞形成A：转染agomir后进行TRAP染色观察破骨细胞形成数目；B：转染antagomir后进行TRAP染色观察破骨细胞形成数目Fig.4 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited osteoclasts formation and knockdown of miR-134-5p (transfected with antagomir) accelerated the formation of the the osteoclasts A: the number of osteoclasts was counted by TRAP staining after transfected with agomir; B: the number of osteoclasts was counted by TRAP staining after transfected with antagomir

图5 miR-134-5p过表达(转染agomir)抑制肌动蛋白环形成，敲低(转染antagomir)促进肌动蛋白环形成A：转染agomir后进行F-actin染色观察肌动蛋白环形成数目；B：转染antagomir后进行F-actin染色观察肌动蛋白环形成数目Fig.5 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited actin ring formation and knockdown of miR-134-5p (transfected with antagomir) accelerated actin ring formation A: the number of actin ring was counted by F-actin staining after transfected with agomir; B: the number of actin ring was counted by F-actin staining after transfected with antagomir

图6 miR-134-5p过表达(转染agomir)抑制破骨分化相关基因表达，敲低(转染antagomir)促进破骨分化相关基因表达A：转染agomir后进行qRT-PCR检测破骨分化相关基因表达；B：转染antagomir后进行qRT-PCR检测破骨分化相关基因表达Fig.6 Overexpression level of miR-134-5p (transfected with agomir) inhibited the expression levels of the osteoclast-related genes and knockdown of miR-134-5p (transfected with antagomir) accelerated the expression levels of osteoclast-related genes A: the expression levels of osteoclast-related genes were measured by qRT-PCR after transfected with agomir; B: the expression levels of osteoclast-related genes were measured by qRT-PCR after transfected with antagomir

4 miR-134-5p 靶 基 因 预 测 为 了 进 一 步 探究miR-134-5p抑制破骨细胞分化的相关机制，通过TargetScan 、miRWalk、miRDB 这三个靶基因数据库在线预测 miR-134-5p的靶基因，对三者所预测的结果绘制韦恩图，得到交集靶基因。结果提示miR-134-5p与Itgb1的3’UTR区域存在结合位点，可能是miR-134-5p潜在的靶基因(图7)。

图7 Itgb1可能是miR-134-5p调控的靶基因A：TargetScan、miRDB及miRWalk预测的miR-134-5p交集靶基因；B：生物信息网站TargetScan预测miR-134-5p可能调控Itgb1以及调控位点区域Fig.7 Itgb1 may be the potential target gene regulated by miR-134-5p A: crosstalk of miR-134-5p target genes predicted by TargetScan, miRDB and miRWalk; B: miR-134-5p potentially targeted Itgb1 genes and its regulatory site region

5 qRT-PCR 及 Western blot检 测 miR-134-5p 靶基因Itgb1和蛋白表达量 qRT-PCR显示，与对照组比较，转染agomir组中Itgb1表达显著降低(P＜0.001)，而转染antagomir组中Itgb1表达升高(P＜0.05；图8)。Western blot检测 Itgb1 蛋白的表达水平，条带结果显示，与对照组相比，转染agomir后Itgb1蛋白表达量减少，转染antagomir后Itgb1蛋白表达量增加，对Western blot条带进行统计分析，也呈现同样的结果(P＜0.01；图9)。

图8 qRT-PCR显示过表达或敲低miR-134-5p对Itgb1基因表达的影响 A：过表达miR-134-5p后Itgb1基因表达降低；B：敲低miR-134-5p后Itgb1基因表达升高Fig.8 Expression level of Itgb1 gene was determined after overexpression or knockdown of miR-134-5p A: the expression level of Itgb1 gene decreased with overexpression level of miR-134-5p; B: the expression level of Itgb1 gene increased with knockdown of miR-134-5p

图9 Western blot显示过表达或敲低miR-134-5p对Itgb1蛋白表达的影响 A：过表达miR-134-5p后Itgb1蛋白表达降低；B：敲低miR-134-5p后Itgb1蛋白表达升高Fig.9 Expression level of Itgb1 protein was determined after overexpression or knockdown of miR-134-5p A: the expression level of Itgb1 protein decreased with overexpression level of miR-134-5p; B: the expression level of Itgb1 protein increased with knockdown of miR-134-5p

讨 论

骨改建是生物体受外界干预后发生的复杂生理性反应，其发生的生物学基础即骨组织的可塑性，也是人们研究的热点和重点[9]。多种细胞参与了骨改建的过程，如成骨细胞、骨髓间充质干细胞、破骨细胞等，其中破骨细胞发挥着重要作用。破骨细胞的发生主要是通过RANK受体激活RANKL，从而引起下游NF-κB和其他信号通路的激活，增强NFATc1的表达，继而引起包括TRAP、MMP9、Cathepsin K等破骨细胞相关基因的表达升高[10]。这一过程受到多种细胞因子和蛋白的调控，其中miRNA的作用不可忽视。miRNA是一类保守性强、内源性的非编码小RNA，由多种酶加工合成，其通过与靶基因mRNA的3’-UTR区域结合起到识别和沉默靶基因的作用[11]。miRNA在包括增殖、代谢和疾病发生等领域都发挥着不同的作用，其中包括骨改建的过程。Guo等[12]研究发现口颌面发育过程中miR-206-3p可以促进成骨，而抑制破骨细胞分化。Liu等[13]发现在TNF-α诱导的骨丢失中miR-1247-5p发挥着重要作用。

在血管平滑肌组织中，Choe等[8]发现miR-134-5p可通过抑制组蛋白去乙酰化酶5促进血管平滑肌细胞中钙沉积。而成骨细胞正是通过钙沉积逐渐形成骨基质，这提示我们miR-134-5p与骨再生密切相关[8,14]。然而，miR-134-5p在骨改建过程中的作用尚未见报道。因此本研究关注于破骨分化，主要探讨了miR-134-5p在破骨细胞分化过程中发挥的作用。

本研究首次发现，利用小鼠BMMs进行破骨诱导分化，miR-134-5p的表达在破骨发展过程中降低，据此我们猜想miR-134-5p在破骨过程中发挥作用。因此，我们通过在BMMs中分别转染miR-134-5p过表达物(agomir)、miR-134-5p敲低物(antagomir)及其各自的阴性对照后进行破骨细胞诱导分化，验证miR-134-5p在其中的具体作用。我们采用TRAP染色和F-actin染色验证破骨细胞的形成[15]。结果显示，与其阴性对照相比，agomir组TRAP染色阳性且细胞核数目大于3的破骨细胞数量和肌动蛋白环数目明显减少，这说明miR-134-5p抑制了骨髓巨噬细胞向破骨细胞的形成和分化。为了进一步验证miR-134-5p在破骨细胞分化中的抑制作用，我们检测了破骨相关基因TRAP、CTSK和NFATc1的表达，在过表达后其均下降，而敲低后均上调，与染色结果一致。这些结果表明，miR-134-5p可以负调控破骨进程从而影响BMMs的破骨分化，这与Dinesh等[16]的结果相似。同样，Zhang等[17]研究发现，miR-134-3p在创伤性股骨头修复中起积极作用，可以促进骨髓间充质干细胞增殖，进而加速骨组织的修复。

接下来，我们寻找miR-134-5p可能的靶标，我们通过生物信息学方法，通过将TargetScan、miRDB和miRWalk三个数据库中关于miR-134-5p可能调控的基因取交集，对miR-134-5p的潜在靶基因进行筛选，发现Itgb1可能是miR-134-5p的潜在靶基因。过表达miR-134-5p会引起Itgb1的mRNA和蛋白表达量减少，从而发挥抑制破骨细胞形成的功能。既往研究表明，整合素受体不仅是细胞黏附和迁移的效应器，在细胞分化过程中也发挥着重要作用。Itgb1可调节神经元和星形胶质细胞的分化、角质形成细胞分化、Ⅱ型肺上皮细胞分化以及软骨发生等，同时Itgb1在多种细胞表面表达，其中包括破骨细胞[18-19]。Wang等[20]在研究中发现Itgb1作为IGFBP1的关键受体，对于其发挥促进破骨细胞生成的功能至关重要。而miR-134-5p和Itgb1的靶向关系及二者在破骨细胞中发挥的作用尚未见报道。

综上所述，miR-134-5p可能通过抑制Itgb1基因表达来抑制破骨细胞形成，从而参与骨改建的过程。但若要明确miR-134-5p对Itgb1基因的具体调控作用，仍需进一步的luciferase实验进行验证，并有必要完善miR-134-5p对破骨细胞分化、凋亡的影响。