藏区濒危药用植物独一味的叶绿体基因组特征

蒲 芬，张德全，2*

（1.大理大学药学院，云南大理 671000；2.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室（培育），云南大理 671000）

独一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo为唇形科独一味属的单种属植物〔1〕，主要分布在青海、甘肃、四川、西藏等省的高海拔地区〔2〕。独一味是藏族的习用药用植物，以其干燥地上部分入药，藏语称“大巴”或“打布巴”。由于该物种受到严重采挖及破坏，资源日趋濒危，被建议列为青藏高原濒危藏药物种〔3〕。该药材还被2020年版《中华人民共和国药典》收录，具有止血、镇痛、抗炎、抗肿瘤、增强免疫等作用〔4-7〕。独一味的化学成分包括黄酮类、环烯醚萜类、苯乙醇苷类、挥发油类等〔8-9〕。目前，国内外对独一味的研究较多，但主要集中在化学成分、药理、药效、临床应用等方面，而分子生物学方面的研究较少。潘正〔10〕基于核糖体内转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）条形码和代谢组技术对藏药独一味的品质进行评价，结果表明，独一味与其代用品美花圆叶筋骨草Ajuga ovalifolia和藏玄参Oreosolen wattii的ITS2条形码存在明显的差异，ITS2可以作为鉴定独一味及其代用品的DNA条形码。Wang等〔11〕也利用ITS2成功地鉴定了独一味及其伪品药材。Liu等〔12〕利用区间简单重复序列（inter-simple sequence repeats，ISSR）标记及随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）分子标记技术对西藏、青海、云南等地独一味的遗传多样性及居群遗传结构进行分析，发现独一味的遗传变异程度较高。但是，目前还没有关于独一味叶绿体全基因组序列方面的研究报道。

叶绿体基因组因结构简单、相对分子量小、保守性好〔13〕，被广泛应用于物种鉴定及系统发育分析。在分子鉴定方面，叶绿体基因组可以作为物种鉴定的超级条形码以及从中筛选高变片段作为物种鉴定的潜在分子标记〔14-15〕；在系统发育方面，叶绿体基因组可有效揭示物种系统发育位置及近缘种间的亲缘关系〔14〕。He等〔16〕对广藿香Pogostemon cablin的叶绿体全基因组进行了报道，发现广藿香的基因结构、GC含量及密码子偏好性与同属物种很相似。Cui等〔17〕对荔枝草Salvia plebeia的叶绿体基因组进行了报道，对荔枝草及已发表的5个同属物种的结构和序列进行比较，并揭示了荔枝草的系统发育关系。此外，与DNA通用条形码相比，叶绿体全基因组包含更丰富的变异位点，物种鉴定效率更高，被视为新一代DNA条形码〔18〕。

本研究利用二代高通量测序技术对独一味进行测序，经组装、注释，得到一条完整的叶绿体全基因组序列。对该基因组的序列特征进行解析，与唇形科中5种重要药用植物的叶绿体基因组进行比较分析，并联合唇形科中29条已发表序列构建系统发育树，为独一味的物种鉴定、资源保护及系统进化等研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本研究中二代测序所用的分子材料为硅胶干燥的独一味叶片，采自云南省迪庆藏族自治州德钦县白马雪山丫口附近（28°21′57.36″N，99°01′44.34″E，海拔4 197 m）。凭证标本经大理大学药学院生药教研室张德全教授鉴定为唇形科独一味属植物独一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo，编号为ZDQ20015，该标本保存于大理大学药学院药用植物与生药标本馆。

1.2 总基因组DNA提取、测序 采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法，从硅胶干燥的叶片中提取DNA，用超声波破碎仪将DNA片段化，经末端修复、片段纯化、加A尾、接测序接头、PCR扩增等过程，形成测序文库。再使用带有双末端pair-end（2×300 bp）文库Illumina Hi S eq 2500平台进行测序，整个测序工作由上海元莘生物医药科技有限公司完成。

1.3 叶绿体全基因组组装、注释 测序完成后得到原始数据，使用Trimmomatic v.0.32软件进行过滤，以益母草（Leonurus japonicus，登录号：NC_038062.1）为参考序列，使用GetOrganelle.py进行组装。再使用Geneious 8.0.2软件对组装得到的叶绿体全基因组序列进行注释，并将最终结果提交至美国国家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库（登录号：MW322685），利用OGDRAW在线软件（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）绘制独一味叶绿体基因组的物理图谱。

1.4 简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）分析 独一味叶绿体基因组中SSR使用MISA软件进行分析。参数设置为单碱基重复最短为10个，二碱基重复最短为5个，三碱基重复最短为4个，四碱基重复最短为4个，五碱基重复最短为3个，六碱基重复最短为3个。

1.5 密码子偏好性分析 采用CondonW 1.4.2软件对独一味叶绿体基因组的密码子偏好性进行分析，获得相关参数，包括第三位上的GC碱基含量（GC3s）、GC含量、相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）以及有效密码子数（effective number of codon，ENC）。

1.6 叶绿体基因组比较 将独一味叶绿体基因组与NCBI数据库中已发表的5种唇形科植物序列（黄芩Scutellariabaicalensis、薄荷Menthacanadensis、丹参Salvia miltiorrhiza、水苏Stachys japonica、线纹香茶菜Isodon lophanthoides）进行对比。利用Excel统计叶绿体基因组的总基因数、GC含量、大单拷贝区（large single copy，LSC）、小单拷贝区（small single copy，SSC）、反向重复区（inverted repeats，IR）的长度等结构特征信息。使用在线工具IRscope（https：//irscope.shinyapps.io/irapp/）对叶绿体基因组IR区比较分析。

1.7 系统发育分析 从NCBI数据库中下载已发表的29种唇形科植物的叶绿体基因组，包括百里香属Thymus（T.japonicus，T.mongolicus）、黄芩属Scutellaria（S.insignis，S.tsinyunensis，S.baicalensis，S.mollifolia）、紫 苏 属Perilla（P.setoyensis，P.frutescensvar.hirtella）、薄 荷 属Mentha（M.canadensis，M.spicata，M.longifolia，M.piperita）、鼠尾 草 属Salvia（S.chanryoenica，S.plebeia，S.japonica，S.miltiorrhiza）、罗 勒 属Ocimum（O.tenuiflorum，O.basilicum）、水 苏 属Stachys（S.japonica，S.chamissonis）、香 科 科 属Teucrium（T.omeiense，T.simplex）、香 茶 菜 属Isodon（I.rubescens，I.serra，I.lophanthoides）以及筋骨草属Ajuga（A.forrestii，A.lupulina，A.decumbens，A.cilita）。以爵床科马蓝属的板蓝Strobilanthes cusia作为外类群。使用MAFFT v.7.1软件将独一味的叶绿体基因组序列与29种唇形科植物的序列进行对比，并使用jModelTest v.2.1.7软件筛选最佳核苷酸替代模型，筛选出最佳核苷酸模型为GTR+I+G。采用贝叶斯法（Bayesian，BI）和最大似然法（maximum likelihood，ML）进行系统发育树构建。BI树利用MrBayes v.3.2.6软件进行构建，马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）算法计算100万代，每隔1 000代取样1次，舍弃前25%的树，根据剩余的样本构建一致树；ML树利用RAxML v.8.2.4软件进行构建，采用快速靴带算法进行计算，重复1 000次。

2 结果与分析

2.1 叶绿体基因组基本特征 独一味的叶绿体基因组呈典型的四分体结构，见图1，全长151 808 bp，其中LSC长83 126 bp，SSC长17 396 bp，一对IR长25 643 bp。全基因组的GC含量为38.5%，IR的GC含量（43.4%）高于SSC（32.6%）和LSC（36.6%）。独一味叶绿体基因组序列共编码107个基因，包括蛋白质编码基因79个，rRNA基因4个，tRNA基因23个，假基因1个（rps19）。该叶绿体基因组序列有11个基因含有内含子，其中2个基因（ycf3、clpP）含有2个内含子，其余9个基因（rps16、atpF、rpoC1、petB、petD、rpl16、rpl2、ndhB、ndhA）含 有1个内含子。独一味叶绿体全基因组基因组成见表1。

表1 独一味叶绿体全基因组基因组成

图1 独一味叶绿体全基因组物理图谱

2.2 SSR分析 独一味叶绿体基因组中共检测到54个SSR，包括31个单核苷酸重复序列，9个二核苷酸重复序列，3个三核苷酸重复序列，10个四核苷酸重复序列，1个五核苷酸重复序列。SSR最丰富的类型为单核苷酸重复序列，而单核苷酸重复序列又以A和T碱基为主。

2.3 密码子偏好性分析 利用CondonW 1.4.2软件对独一味叶绿体基因组的密码子偏好性进行分析。结果显示，独一味叶绿体基因组的ENC值为55.93，更偏向于61.00，说明独一味叶绿体基因组的密码子偏好性较弱。此外，该叶绿体基因组的GC3s含量为36.6%，GC含量为38.5%，两者均小于50.0%，说明独一味叶绿体基因组偏向使用A和T两种碱基。对该叶绿体基因组的RSCU值进行分析，RSCU值＞1的密码子有32个，其中以A和U碱基结尾的密码子有27个（占84.4%），说明编码独一味叶绿体基因组的密码子偏好以A和U碱基结尾。该叶绿体基因组共有61种密码子，编码20种氨基酸，所有注释基因共由50 902个密码子编码，其中编码亮氨酸的密码子最多，共有4 966个；编码色氨酸的密码子最少，共有670个。

2.4 基因组基本特征比较 唇形科6种药用植物的叶绿体基因组长度为150 599～152 731 bp，GC含量均为38.0%左右，基因总数略有不同。LSC占序列长度的绝大部分，其长度为81 701～83 950 bp，其中黄芩的LSC最长。SSC长度为17 396～17 700 bp，IR长度为25 539～25 700 bp，其中线纹香茶菜的SSC及IR最长。见表2。

表2 独一味与唇形科其他5种药用植物叶绿体基因组的基本特征

2.5 IR边界分析 叶绿体基因组普遍存在扩张和收缩的现象，且不同物种间存在不同程度的差异。对唇形科6种药用植物叶绿体基因组IR边界进行分析，研究表明，位于IR边界的基因有rps19、rpl2、ycf1、ndhF。所有物种的IRb-SSC边界均在ndhF基因内，SSC-IRa边界均在ycf1基因内。rpl2基因位于IR，trnH基因位于LSC，距边界均有一段距离。rps19位于4种植物的LSC-IRb边界上，而在薄荷及线纹香茶菜中位于LSC，距边界均为87 bp。见图2。

图2 唇形科6种药用植物叶绿体基因组IR边界分析

2.6 系统发育分析 本研究中基于独一味与唇形科29条叶绿体基因组构建的BI树与ML树，其拓扑结构基本一致，各分支节点的支持率均为100%，可信度较高。外类群板蓝最先从系统发育树中分化出来。此系统发育树聚为两支：香茶菜属Isodon、罗勒属Ocimum、紫苏属Perilla、薄荷属Mentha、百里香属Thymus、鼠尾草属Salvia聚为一支，而黄芩属Scutellaria、水苏属Stachys、独一味属Lamiophlomis、筋骨草属Ajuga、香科科属Teucrium聚为另一支。独一味属与水苏属亲缘关系最近，其次为黄芩属。见图3。

图3 基于叶绿体全基因组构建独一味与相关物种的BI树与ML树

3 讨论

本研究首次报道了独一味叶绿体基因组，并对其叶绿体基因组特征进行了解析。结果显示，独一味的叶绿体基因组全长151 808 bp，GC含量为38.5%，共编码了107个基因，结果与大多数被子植物的叶绿体基因组特征相似。对唇形科6种药用植物叶绿体基因组特征进行比较，叶绿体基因组长度为150 599～152 731 bp，GC含量均为38.0%左右，说明唇形科叶绿体基因组的长度与GC含量具有保守性。在叶绿体基因组进化过程中，IR区边界会发生收缩和扩张，本研究位于IR边界的基因有rps19、rpl2、ycf1、ndhF，所有物种的IRb-SSC边界均在ndhF基因内，SSC-IRa边界均在ycf1基因内，说明唇形科的IR边界较为保守，这与沈立群〔19〕研究结果相类似。

密码子偏好性在自然界中广泛存在。目前，密码子偏好性研究在许多生物学领域受到关注，如预测基因表达水平、优化基因表达、揭示基因进化规律等领域〔20〕。对独一味的密码子偏好性进行分析，结果显示，RSCU值＞1的密码子有32个，其中以A和U碱基结尾的密码子有27个，占84.4%，偏好以A和U碱基结尾，这与苦荞Fagopyrum tataricum〔21〕、苦豆子Sophora alopecuroides〔22〕等双子叶植物中叶绿体密码子偏好以A和U碱基结尾的结果相一致。

独一味的地上部分是一味传统藏药，具有活血化瘀、消肿止痛的功效。美花圆叶筋骨草、藏玄参等植物与独一味形态相似，易于混淆，常作为药材独一味的代用品〔11〕。本研究对独一味的叶绿体基因组特征进行了分析，为独一味与其代用品的分子鉴定提供了理论依据。本研究基于唇形科叶绿体基因组序列，构建了11个属30个种的系统发育树。结果表明，独一味属与水苏属亲缘关系最近，其次为黄芩属，这支持传统的分类处理〔1〕。但是，传统分类中同属于野芝麻亚科的紫苏属、薄荷属、百里香属、鼠尾草属、水苏属、独一味属并未聚在一起，本研究结果更支持Li等〔23〕基于分子证据对这些类群的分类处理。本研究首次对独一味属植物（单种属）进行叶绿体全基因组报道，对濒危药用植物独一味的资源利用和保护、独一味属与近缘属间系统发育关系的探讨都提供了科学依据。