齿瓣石斛水提物对环磷酰胺免疫抑制模型小鼠的影响

周 涛，黄行行，赵莹莹，艾 馨，缪志敏，赖 泳

（大理大学药学院，云南大理 671000）

免疫低下会影响机体正常生理活动，引起各种疾病。免疫调节能力包括机体对外界生物侵入的抵抗能力、识别机体内恶性细胞的探测能力以及消除体内衰亡细胞和无用物质的自我调节稳定能力〔1〕。相关研究发现炎症、肿瘤、类风湿关节炎等多种疾病的发生与免疫功能失调密切相关〔2〕。近年来，黄芪、金银花、板蓝根等传统增强免疫力的中药材研究逐渐成熟，石斛作为众多提升免疫功能中药中的一个新的热点，受到了广泛关注。

兰科石斛属植物是珍稀名贵中药材，中国有近80种，被认定具备药用价值的种类已超过50种〔3〕。石斛具有免疫调控、抗肿瘤、抗氧化、调节血脂等作用〔4〕。齿瓣石斛Dendrobium devonianumPaxt.俗称紫皮石斛、紫皮兰、香棍草，具有润肺止咳、养胃生津功效，为药用石斛的重要成员。研究表明齿瓣石斛水提取物（Dendrobium devonianumwater extract，DDWE）存在良好的体外抗菌作用，多糖成分一定程度上有提高小鼠免疫活性的能力〔5〕。近期相关研究提示，齿瓣石斛可能在免疫受损者的免疫功能调节中发挥着重要作用，但并未阐明机体病理生理发生进展过程〔6〕。因此本实验构建环磷酰胺（CTX）免疫抑制小鼠模型，通过DDWE对小鼠免疫功能的改变进行研究，为齿瓣石斛进一步开发利用提供理论基础与科学依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级健康昆明种雄性小鼠，体质量18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 药品与试剂 齿瓣石斛由云南省龙陵天中药有限公司提供，经大理大学药学院生药教研室张德全教授鉴定为齿瓣石斛，DDWE由本实验室提取；CTX购自上海瀚思化工有限公司；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养基（双蒸水配制）均购自美国Gibco公司，批号：1618862和1786045；四甲基偶氮唑盐（MTT）购自Beyotime公司，批号：ST316；二甲基亚砜（DMSO）、冻存用DMSO和伴刀豆球蛋白A（ConA）均购自美国Sigma公司，批号：302A0325、RN13D8013和C8110；中性红染色液、绵羊血红细胞均购自南京森贝伽生物科技有限公司，批号：G1015、Sbjser99；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）购自Solarbio公司，批号：D804D044；NaHCO3、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）抗凝剂均购自天津市风船生化材料有限公司；红细胞（RBC）裂解液、CD3+抗体、CD4+抗体和CD8+抗体均购自美国Biolegened公司，批号：420301、10020350、10040750、10071125；稀释液、鞘液、溶血剂均购自美国Millipore公司；免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与白细胞介素-2（IL-2）酶联免疫吸附试验（ELISA）检验试剂盒均购自南京建成生化试剂有限公司，批号：A0115、A0113、A0108、A0119、A0102。

1.3 仪器 MJ-54A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；LGJ-10F型冷冻干燥机（富阳市盛大机电有限公司）；311-CO2恒温培养箱（美国Thermo Scientific Forma公司）；CKX41倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；Synergy HT多功能酶标仪（美国BioTek公司）；GL-20M高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心器材有限公司）；XW-80A旋涡混合器（中国其林贝尔科技有限公司）；MPC-2000型96孔板离心机（Galanz公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）；XFA6100全血细胞分析仪（南京普朗仪器制造有限公司）。

2 方法

2.1 DDWE的制备 取齿瓣石斛生药8 664.0 g，55℃干燥6 h，粉碎放入桶中，加60%乙醇溶液浸泡3 d，用双层医用纱布过滤，滤去药渣，继续加60%乙醇，反复操作共5次。将滤液旋蒸浓缩，得醇提物浸膏2 570.5 g，4℃恒温密封保存。将剩余的药渣取出，避光晾干、称重得8 153.5 g，55℃干燥6 h，置于装有纯水煎锅中，按照料液比1∶10的比例煎煮，沸腾后继续煮1.5 h，过滤，得滤液，重复3次。合并所有水提物溶液，旋蒸浓缩并冻干，-40℃提前预冻，待水溶液均匀分布于冻干瓶内壁，-80℃过夜。得水提物冻干粉858.579 g（得率10.53%），置于离心管中密封保存，备用。

2.2 实验小鼠分组、造模及给药 将小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组及DDWE低、中、高剂量组，第1、2、3天除空白组外，其余各组小鼠均腹腔注射0.04 g/kg CTX制备免疫抑制模型。空白组和模型组小鼠灌胃0.9%氯化钠溶液0.02 g/（kg·d），阳性对照组灌胃0.04 g/（kg·d）的左旋咪唑，DDWE低、中、高剂量组分别灌胃0.25、0.50、1.00 g/（kg·d）的DDWE，1次/d，试验周期30 d。

2.3 巨噬细胞制备及吞噬中性红实验 小鼠连续3 d腹腔注射5%可溶性淀粉1 mL，分泌腹腔巨噬细胞。第4天断椎处死小鼠，75%乙醇中冷浸5 min，注入冷磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4），腹部剪口，吸出腹腔液置无菌离心管中，重复3次，收集小鼠腹腔内的巨噬细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入RBC裂解液，2 min后加PBS终止裂解，混合均匀后1 000 r/min离心5 min，弃上清，加PBS清洗，1 000 r/min离心10 min，弃上清，得纯化巨噬细胞，加含10%FBS的RPMI 1640培养基，混合均匀，得细胞悬液计数，调整细胞密度为5×105个/孔。将上述巨噬细胞置于5%CO2培养箱内37℃孵育，48 h后，待其充分紧贴内壁，弃上清，温PBS洗涤2次，每个加样孔添加100μL中性红染色材料（0.9%氯化钠溶液稀释），孵育30 min，弃上清，PBS冲洗2次，每孔添加100μL RBC裂解液（乙酸∶无水乙醇=1∶1），4℃过夜，测量540 nm处吸光度（OD）值，以OD值×10大小表示小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力。

2.4 脾脏指数与脾淋巴细胞转化实验 于实验终点，小鼠称重，断椎处死，灭菌条件下取脾脏，0.9%氯化钠溶液洗净后擦干，称重，计算脾脏指数（脾脏湿质量/体质量×10），后置于装有灭菌PBS的培养皿中剪碎、研磨、过滤，收集滤液置离心管，1 200 r/min离心10 min，弃上清，加0.6 mL RBC裂解液裂解红细胞，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用PBS、RPMI 1640培养基各洗1次，加RPMI 1640完全培养液（含10%FBS，青霉素、链霉素各100μg/mL）。为除去吞噬细胞将脾细胞置皮氏培养皿中37℃孵育1 h，收集非贴壁的脾淋巴细胞，细胞浓度调整至1.5×106个/mL，台盼蓝染色测细胞存活率大于95%。对照孔中加RPMI 1640培养基100μL，ConA孔加ConA（15μg/mL）溶液100μL，每只小鼠设置3个平行孔，结束后置于37℃、5%CO2培养箱内，48 h后取出细胞，每孔加20μL MTT（5 g/L），再次孵育4 h，取96孔板，1 000 r/min离心10 min，弃上清，每孔加150μL DMSO裂解细胞，37℃避光孵育10 min，490 nm处测定OD值，计算刺激指数（SI）。多项研究〔7-9〕使用SI代表小鼠脾淋巴细胞增殖能力，S I值增加代表脾淋巴细胞增殖能力加强。

2.5 全血细胞分析与外周血T淋巴细胞亚群检测末次灌胃后12 h，各组小鼠眼球取血，加入含100 μL饱和EDTA-Na2溶液的EP管中。全血经过EDTA-N a2抗凝处理后采用血细胞分析仪测定外周血中各种血细胞数。每个样本取出70μL装入流式管，每个流式管中加10μL抗体，混合均匀后避光30 min，加1 mL RBC裂解液的稀释液（原液∶双蒸水=1∶9），混合均匀，避光孵育10 min，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加3 mL FBS，避光10 min，1 200 r/min离心10 min，弃上清，加400μL FBS，流式细胞仪检测CD4＋、CD8＋含量，计算CD4＋/CD8＋。

2.6 小鼠血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α与IL-2的含量测定 实验结束前1周，每只小鼠腹腔注射积压绵羊血红细胞0.2 mL，给药7 d致敏小鼠。末次灌胃12 h后，眼球取不抗凝全血1 mL，置于EP管中，4℃静置过夜，3 000 r/min离心10 min，取上清，为小鼠血清。根据ELISA说明指导中的操作规范进行操作。

2.7 统计学分析 采用SPSS 17.0软件处理数据，数据以（x±s）表示，不同组别对比采取单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 DDWE对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能、脾脏指数与脾淋巴细胞增殖能力的影响 与空白组相比，模型组巨噬细胞吞噬功能、脾脏指数与脾淋巴细胞增殖能力显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，阳性对照组和DDWE中、高剂量组显著促进免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性（P＜0.01）；阳性对照组和DDWE各剂量组显著增强其脾脏指数（P＜0.05）；阳性对照组与DDWE高剂量组显著增强其脾淋巴细胞增殖能力（P＜0.01）。与阳性对照组相比，DDWE低、中剂量组促进免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬活性与提高脾脏指数的程度低（P＜0.05）；DDWE低剂量组增强其脾淋巴细胞增殖能力程度较低（P＜0.05）。见表1。

表1 DDWE对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能、脾脏指数与脾淋巴细胞增殖能力的影响（x±s，n=5）

3.2 DDWE对免疫抑制小鼠外周血细胞数与T淋巴细胞亚群的影响 与空白组比较，模型组小鼠外周血中白细胞、红细胞与CD4＋/CD8＋水平均显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，阳性对照组与DDWE各剂量组中免疫抑制小鼠外周血白细胞与CD4＋/CD8＋水平显著升高（P＜0.05）；阳性对照组能增强其外周血红细胞水平（P＜0.05）。与阳性对照组相比，DDWE各剂量组提高免疫抑制小鼠外周血白细胞与CD4＋/CD8＋水平程度低（P＜0.05）；DDWE低、中剂量组增强其外周血红细胞水平程度低（P＜0.01）。见表2、图1。

图1 流式细胞仪检测图（x±s，n=10）

表2 DDWE对免疫抑制小鼠外周血细胞数与T淋巴细胞亚群的影响（x±s，n=10）

3.3 DDWE对免疫抑制小鼠血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α与IL-2水平的影响 与空白组相比，模型组小鼠血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α与IL-2水平降低明显（P＜0.01）。与模型组相比，阳性对照组、DDWE高剂量组能显著增加免疫抑制小鼠血清中IgG水平（P＜0.01）；阳性对照组与DDWE各剂量组中IgA、IgM与IL-2水平显著升高（P＜0.05）；阳性对照组及DDWE中、高剂量组中TNF-α水平明显升高（P＜0.05）。与阳性对照组相比，DDWE各剂量组提高免疫抑制小鼠血清中IgG、IgM、TNF-α与IL-2水平程度低（P＜0.05）；DDWE低剂量组增强其血清中IgA水平程度低（P＜0.01）。见表3。

表3 DDWE对免疫抑制小鼠血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α与IL-2水平的影响（x±s，n=10）

4 讨论

CTX可通过影响非特异性有丝分裂原ConA来抑制T淋巴细胞的增殖活性，间接影响B淋巴细胞的活化〔10〕。同时，CTX也会干扰血清中免疫细胞因子的产生〔11〕。此外，通过干扰DNA和RNA功能影响淋巴细胞的毒性也是其重要的免疫效应〔12〕。

本研究发现IgG、IgA和IgM作为重要的人体免疫因子，介导针对病毒和细菌的天然免疫，刺激巨噬细胞以及促进其对病毒和细菌的吞噬作用在体液免疫中发挥重要作用〔1，13〕。作为一种多效性炎症细胞因子的TNF-α，不仅能激活淋巴细胞和巨噬细胞等各种免疫细胞，增强其杀伤活性，还可以通过刺激具有免疫抑制作用的细胞发挥共抑制活性〔14〕。此外，免疫刺激因子IL-2，通过促进B淋巴细胞的增殖和分化与诱导淋巴因子激活杀伤细胞来控制免疫调节〔15〕。本实验中，CTX免疫抑制小鼠血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α和IL-2表达水平在DDWE给药后呈剂量依赖性提高。与此同时，通过中性红吞噬实验，我们进一步证实了DDWE能增强CTX免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，能显著提高免疫抑制机体的非特异性免疫水平。众多研究表明，中草药可通过识别免疫细胞表面Toll样受体（TLR4）激活细胞内核因子κB（NF-κB）与丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路，导致免疫细胞因子的释放进而发挥免疫调节作用〔16-17〕。此外，霍山石斛多糖通过TLR4刺激NF-κB与抑制蛋白（IκB），使得IκB发生磷酸化降解，NF-κB迅速从细胞质移位到细胞核，在核内与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因上的κB位点结合，增强巨噬细胞iNOSmRNA的表达，刺激巨噬细胞促进TNF-α的分泌；也可以通过TLR4与配体结合，使MAPKs磷酸化，激活NF-κB，最后启动转录促进iNOS的表达，活化巨噬细胞诱导TNF-α的产生〔18〕。本研究同样发现巨噬细胞吞噬能力的增强与TNF-α分泌水平的提高显著相关。因此，推测DDWE提高巨噬细胞吞噬活性可能与TLR4介导的NF-κB与MAPKs信号通路之间存在密切联系，但具体的机制仍需更多基础研究进行验证。

脾脏作为重要的外周免疫器官，是T、B淋巴细胞成熟、分化及免疫应答的重要场所，其体积大小是评价非特异性免疫水平的一项重要指标〔19〕。本实验中，DDWE的使用显著增加了脾脏指数，提高淋巴细胞增殖活性，改善机体免疫功能。结果表明，DDWE同样能够刺激免疫抑制机体淋巴细胞增殖，增强免疫应答。

白细胞是维持机体稳态不可或缺的细胞，也是反映机体免疫调节能力的一项重要参考指标〔20〕。免疫学研究中，CD4+代表辅助T淋巴细胞，协助B淋巴细胞、巨噬细胞及杀伤性T淋巴细胞发挥免疫功能；CD8+代表细胞毒性T淋巴细胞，可特异性杀伤靶细胞〔21〕。二者相互调节，在调控免疫反应和维持免疫稳态中发挥重要作用，CD4+/CD8+的水平间接反映机体细胞免疫功能。本实验中，DDWE显著提高免疫抑制小鼠CD4+/CD8+表达水平，使其由免疫抑制状态向免疫功能正常状态转化，并且显著增加免疫抑制小鼠白细胞数，这也更好地表明DDWE能显著改善免疫抑制机体的细胞免疫状态。

综上所述，本研究发现针对CTX诱导的免疫功能抑制小鼠，DDWE能够显著增强其非特异性免疫、细胞免疫与体液免疫，其机制可能与TLR4介导NF-κB与MAPKs信号通路进而增强巨噬细胞吞噬活性和促进TNF-α分泌相关。这为齿瓣石斛在治疗免疫系统疾病方面的进一步开发利用提供了实验依据和潜在方向。