基于网络药理学探寻蛇床子改善睡眠的分子机制

郭晋良，冯玛莉

（山西省中医药研究院，山西 太原 030012）

睡眠是人不可或缺的生命活动，机体通过充足的睡眠来保证生命各项功能的正常与稳定［1］。随着社会发展及生活方式的转变，人们压力逐渐增大，致使失眠人群逐年增多，发病率高达为30%～35%［2］。长期睡眠不足，不仅造成生理机能紊乱，影响人们身心健康及生活质量，严重时还将并发高血压、心绞痛等各种疾病，甚至死亡。目前广泛用于临床的镇静催眠化学药物，短期疗效好、靶点单一明确，但长期口服后出现耐药性、成瘾性等，副反应大且很难以从根本上提高睡眠质量［3，4］。故从中药材或天然药物中寻求催眠作用显著的活性成分，从突触传递、受体信号通路、膜电位、神经递质运输等生物过程调节探索其作用机制，为现代新型治疗睡眠障碍药物的研发提供一定的理论基础。

蛇床子为伞形科蛇床属植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果实。除传统已知功效，现代药理学研究表明其在神经系统、抗肿瘤、中枢抑制、镇静催眠等方面效果显著［5-7］，马澜等［8］对蛇床子的宿醉反映及耐受性做了相关探究，发现蛇床子镇静催眠作用显著，且宿醉反应和耐受性等较地西泮小，可见它在改善睡眠方面具有较好的临床应用前景，此外对其香豆素类成分的安神功效、催眠作用及其机制做了相关研究［9，10］，但由于实验的局限性，目前活性成分及其作用机制尚不完全清楚。

网络药理学是基于大数据的分析平台，通过筛选中药中有效化合物成分，结合相关疾病数据，构建出药物作用于疾病的靶点及机制网络，对药物作用及机制的相关数据进行挖掘［11，12］。应用多种数据库及相关软件，对数据进行可视化处理，以直观反映药物与疾病的关联程度，预测出药物在体内的靶蛋白及相互作用蛋白，同时分析这些蛋白所涉及的信号通路［13，14］。本研究基于网络药理学通过药物-疾病-靶点网络探索蛇床子催眠作用可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 数据库

中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php）；Uniprot 数据库（https：// www.uniprot.org/）；Drugbank（https：//www. drugbank. ca/）；Gene Cards（https：//www.genecards.org/）；venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；String 数据库（https：// string-db.org/，Version 11.0）；Metascape 数据库（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）.

1.2 分析软件

Cytoscape 3.7.2 软件；Omicshare 软件（https：//www.omicshare.com/tools/）.

1.3 蛇床子活性成分筛选

在TCMSP 数据库中输入关键词“蛇床子”，将口服生物利用度（OB）＞30%，类药性（DL）＞0.18作为筛选条件，检索出蛇床子的有效活性成分。

1.4 蛇床子有效成分的靶点筛选

利用TCMSP 的相关靶点的检索功能，依次输入蛇床子有效活性成分对应的MOL ID，得到200种主要活性成分对应的潜在作用靶点，删除重复值最终获得55 种靶点，将所获得的靶点名称输入Uniprot 数据库，选择“reviewed”信息及“human”物种限定，检索这些靶点名称对应的Gene Symbol 备用。

1.5 失眠相关靶点筛选

以疾病名称“insomnia”分别在Drugbank、Gene Cards 数据库进行检索，将筛选结果归纳并去除重复基因，得到与失眠相关的靶基因。

1.6 蛇床子有效成分-失眠-靶点网络构建

分别上传药物潜在靶点与疾病相关靶点名称于Uniprot 数据库，选择“reviewed”信息，种属“Human”，获取靶点的标准基因名；二者筛选后的靶点上传至https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/绘制韦恩图取交集；将上述信息处理后上传至Cytoscape 3.7.2 构建蛇床子活性成分-疾病-靶点图。

1.7 PPI 网络分析及核心靶点筛选

将蛇床子的蛋白靶点导入String 数据库，默认交互作用大于0.4 的靶点，勾选隐藏游离节点，构建出蛇床子改善失眠症状的蛋白互作网络。下载文件信息输入到Cytoscape 3.7.2 软件中，根据节点重要性，调整对应图形大小，最终输出可视化图，以确定蛋白互作网络中的核心基因。

1.8 催眠生物过程与通路富集分析

将蛇床子治疗失眠的潜在靶点导入Metascape平台，物种Homo sapiens”，选择个性化分析，设置P＜0.01，对蛇床子催眠作用靶点进行基因本体（GO）分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路的富集分析，排名靠前的催眠生物过程使用Omicshare 软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 蛇床子主要活性成分及作用靶点

利用TCMSP 检索OB＞30%、DL＞0.18 的活性成分19 种，见表1，根据MOL ID 找到对应靶点200 个，删除重复值保留55 个靶点信息，经Gene-Cards，Drugbank 检索与失眠相关。应用在线韦恩图制作网站将蛇床子活性成分靶点和与失眠相关的作用靶点取交集，韦恩图见图1，共得到潜在作用靶点27个，分别是CHRM1、GABRA1、PIK3CG、MAOB、PTGS1、KCNH2、DRD1、CHRM3、GABRA2、CHRM4、ADRB2、SLC6A4、OPRM1、CHRNA7、ESR1、AR、GSK3B、CHRM2、ADRA1B、ADRA2A、SLC6A2、SLC6A3、PLAU、ADRB1、HTR2A、ADRA1A、GABRA3。对应的活性成分12个，即ammidin、xanthoxylinN、（E）-2，3-bis（2-keto-7-methoxy-chromen-8-yl）acrolein、stigmastero、prangenidin、o-isovalerylcolum bianetin、O-acetylcolumbianetin、diosmetin、cniforin A、cnidimol B、beta-sitosterol、ar-curcumene.

图1 蛇床子活性成分-失眠-靶点韦恩图Fig 1 Active component of Fructus cnidii - insomnia -target Venn plot

表1 经OB 和DL 筛选的蛇床子活性成分Tab 1 Active components of Fructus cnidii screened by OB and DL

2.2 活性成分-疾病-靶点网络

使用Cytoscape 3.7.2 构建活性成分-疾病-靶点网络图，如图2 所示。

图2 活性成分-疾病-靶点网络Fig 2 Active ingredient- disease - target network

其中中心“圆形”表示失眠疾病名称，“绿色三角”表示蛇床子12 种活性成分，“红色倒三角形”表示失眠作用靶点。连接线越多图形显示越大，越能直观反映关键节点信息。12 种活性成分与27 个靶点相关，其中stigmasterol、O-acetylcolumbianetin、o-isovalerylcolum bianetin、xanthoxylin N、prangenidin、beta-sitosterol 作用靶点多，而对应活性成分较多的靶点分别是：PTGS1、PIK3CG、GABRA1、CHRM1、CHRM3、ESR1 这些可能为蛇床子改善失眠的关键活性成分和关键作用靶点。

2.3 蛋白相互作用网络构建与分析

将蛇床子的靶点蛋白导入String 数据库，物种“人”，选择交互作用大于0.4 的靶点构建蛋白互作网络，如图3 所示，隐藏游离节点，边代表靶点间的关联，粗细代表关联分值不同，若边越粗，则关联分值也越大，不同颜色区分不同证据类型。蛋白互作网络中，共27 个节点，78 条边，平均节点度为5.78，平均局部聚类系数0.534。 将数据导入catosape 软件进一步直观分析，其中SLC6A4、ADRA1B、HTR2A、SLC6A2、CHRM1、CHRM2 等为网络的核心靶点，在蛋白互作网络中发挥关键调控作用。

图3 蛇床子靶点蛋白相互作用网络Fig 3 Target protein interaction network of Fructus cnidii

2.4 生物功能与通路富集分析

使用Metascape 数据库对蛇床子治疗失眠的27 个潜在靶点进行GO 注释分析和KEGG 通路分析，并且通过Omicshare 进行可视化分析。结果见图4。

图4 GO 富集分析Fig 4 GO enrichment analysis

GO 注释分析包括3 部分，分别为生物过程（biological process，BP）、细胞组成（celluar component，CC）、分子功能（molecular function，MF）［15］。GO分析显示，在生物过程方面，这些靶点涉及化学突触传递（chemical synaptic transmission）、G 蛋白偶联受体信号通路，偶联环核苷酸对膜电位的二次信息调节（G protein-coupled receptor signalinq pathway，coupled to cyclic nucleotide second messenger）、膜电位调节（regulation of membrane potential）、神经递质运输（neurotransmitter transport）、单胺运输（monoamine transport）、离子输运调节（requlation of ion transport）、developmental growth、突触传递的正调控（positive requlation of synaptic transmission）、细胞对有机循环化合物的反应（cellular response to organic cyclic compound）、内存调节（memory）、体液水平调节（regulation of body fluid levels）、信号受体的活动调节（requlation of signaling receptor activity）、organ growth、response to ethanol、钙离子跨膜转运的调节（requlation of calcium ion transmembrane transport）等生物过程。在CC 分析中靠前的分别是突触后膜（postsynaptic membrane）、膜筏（membrane raft）、谷氨酸突触（glutamatergic synapse）、树突膜（dendrite membrane）、细胞质囊泡膜（cytoplasmic vesicle membrane）等细胞组分。分子功能方面涉及G 蛋白偶联胺受体活性（G protein-coupled amine receptor activity）、肾上腺素能受体的活动（adrenergic receptor activity）、神经递质受体活性参与调控突触后膜电位（neurotransmitter receptor activity involved in requlation of postsynaptic membrane potential）、铵离子结合氯离子（ammonium ion binding）、跨膜转运活性（chloride transmembrane transporter activity） 、β-连 环 蛋 白（beta-catenin binding）、绑定阳离子通道活动（cation channel activity）、蛋白域特异性结合（protein domain specific binding）等分子功能。

KEGG 通路分析显示，见图5。蛇床子催眠靶点涉及靠前的通路主要有刺激神经组织中的交互通路（neuroactive ligand-receptor interaction）、钙信号通路（calcium signaling pathway）、胆碱能突触（cholinergic synapse）、CGMP-PKG 信号通路（CGMP-PKG signaling pathway）、吗啡成瘾（morphine addiction）、含血清素的神经突触（serotonergic synapse）、多巴胺能神经突触信号（dopaminergic synapse）等信号通路。

3 讨论

失眠中医称“不寐”，阳不入阴，虚阳外浮而夜寤不寐，蛇床子具有补肾壮阳功效，虚阳之体通过温补肾阳达到阴平阳秘，阳入于阴而不寐自愈［16］。现代药理学研究表明蛇床子具有中枢抑制作用［17］，仝立国等［18］利用指纹图谱与药效相关性分析蛇床子镇静催眠活性目标化合物，包括蛇床子素、欧前胡素外，新发现佛手柑内酯、异虎耳草素等5 种具催眠活性的单体成分。

本次筛选得到蛇床子19 个有效活性成分，其中12 个具有潜在调节睡眠作用。作用靶点较多的个活性成分为stigmasterol、O-acetylcolumbianetin、o-isovalerylcolum bianetin、xanthoxylin N、prangenidin、beta-sitosterol，有相关文献报道其总香豆素类成分镇静催眠作用［9］。对应活性成分较多的靶点PTGS1、PIK3CG、GABRA1、CHRM1、CHRM3、ESR1 可能为蛇床子改善失眠的关键活性成分和作用靶点。PTGS1 为环氧合酶-1 是化学药佐匹克隆治疗失眠的作用目标酶之一，也可能为蛇床子改善睡眠的靶点目标［19］。GABRA1 是大脑中主要抑制性神经递质γ-氨基丁酸异五聚体受体的一个组成部分，抑制性γ-氨基丁酸能突触的形成，它是大多数镇静催眠化学药物的目标受体，例如安定、佐匹克隆等药物［20］，推测蛇床子作用受体相同。ESR1是雌激素受体蛋白，雌激素分泌水平影响睡眠，女性绝经期会引发更年期潮热、盗汗等导致入睡困难，因而蛇床子可能通过作用于这种蛋白，调节更年期的睡眠障碍［21，22］。

本文通过富集分析得出蛇床子主要的12 个活性成分作用于27 个关键靶标，作用于刺激神经组织的中的交互通路、钙信号通路、胆碱能突触、CGMP-PKG 信号通路含血清素的神经突触、多巴胺能神经突触信号等信号通路发挥作用。该过程涉及GO 分析所得的化学突触传递、G 蛋白偶联受体信号通路，偶联环核苷酸对膜电位的二次信息调节、膜电位调节、神经递质运输、单胺运输、离子输运调节、突触传递的正调控、细胞对有机循环化合物的反应、内存调节、体液水平调节、信号受体的活动调节、钙离子跨膜转运的调节生物过程。G 蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素能受体的活动、神经递质受体活性参与调控突触后膜电位、铵离子结合氯离子、跨膜转运活性、β-连环蛋白、绑定阳离子通道活动、蛋白域特异性结合等分子功能。突触后膜、膜筏、谷氨酸突触、树突膜、细胞质囊泡膜等细胞组分。SLC6A4、ADRA1B、HTR2A、SLC6A2、CHRM1、CHRM2等靶标是PPI 网络的关键靶蛋白，这些靶点也是核心调控基因。SLC6A4 为血清素转运蛋白，其在中枢神经系统中的主要功能包括通过将血清素分子从突触间隙转运回突触前末端进行再利用来调节血清素能信号，在调节血清素对血清素能系统的其他受体的可用性中起着关键作用，药物通过调节体内5-羟色胺水平可改善睡眠［23-25］。ADRA1B 作为G 蛋白偶联受体超家族成员，通过与激活磷脂酰肌醇-钙第二信使系统的G 蛋白结合来介导发挥作用，它是去甲肾上腺素的主要靶受体之一，蛇床子可能通过抑制其释放可调节睡眠［26］。HTR2A 为5-HT 的G 蛋白偶联受体［27］，可作为各种药物和精神活性物质的受体，通过鸟嘌呤核苷酸结合蛋白触发信号传导以调节下游效应物的活性［28］，同时，信号可激活磷脂酶和磷脂酰肌醇-钙第二信使系统，用于调节磷脂酰肌醇3-激酶的活性并促进钙的释放影响神经活动，从而在行为调节中发挥作用，包括对精神活性物质的反应及失眠情况［29］。SLC6A2 为胺转运蛋白，通过去甲肾上腺素的高亲和力钠依赖性进入突触前末端来减少突触部位去甲肾上腺素的降解，延长神经递质的兴奋性，蛇床子可能通过提高去甲肾上腺素的作用时间调节睡眠［30，31］。睡眠调节还涉及分布在大脑区域的特殊神经元之间相互依赖的信号传递，而胆碱能通路对于快速眼动睡眠是必需的，并且Niwa 等［32］通过实验发现表明毒蕈碱乙酰胆碱受体CHRM1 和CHRM3对睡眠调节至关重要，尤其是对快速眼动睡眠。CHRM2 作为毒蕈碱乙酰胆碱受体，同样可对睡眠进行调节［33］。

本研究基于网络药理学的方法预测了蛇床子催眠的药效物质基础、关键靶标及信号通路，明确其发挥作用化学成分。通过建立蛇床子药效成分-失眠-靶点网络图，多角度探索蛇床子改善睡眠的潜在作用机制，通过调控相关生物过发挥其改善失眠的功能。虽有部分成分及靶蛋白有相关实验证实，但通路有待进一步的基础研究及临床试验的确证，仍需要后续实验的验证与支持。

作者贡献度说明：

郭晋良：论文撰写及修改；冯玛莉：提出修改建议。