氟胺酮和氯胺酮的毒性比较研究*

李锋，杨梦香，赖苗军，乔艳玲，5，魏佳韵，崔巍，沈昊伟，王优美，5，徐鹏，5**，狄斌**

（1.中国药科大学，江苏 南京 210009；2.国家禁毒委员会办公室-中国药科大学禁毒关键技术联合实验室，北京 100193；3.宁波大学医学院，浙江 宁波 315211；4.浙江省戒毒研究重点实验室，宁波市康宁医院，浙江 宁波 315201；5.毒品监测管控与禁毒关键技术公安部重点实验室，公安部禁毒情报技术中心，北京 100193）

苯环利啶类物质是一类非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体拮抗剂，氯胺酮是该类精神活性物质的代表性物质。与氯胺酮结构和作用相似的一类药物滥用现象逐渐显现，如氟胺酮、MXE、DCK 和NENK 等，而国内氟胺酮的滥用现象尤为突出[1-2]。氟胺酮于1987 年由王世玉等首次合成[3]，尚无合法的医疗用途。近年来，奥地利、瑞士、美国、英国、荷兰、加拿大、西班牙、丹麦等国家在缴获物、全血及毛发样品中陆续检出了氟胺酮[4-7]。而我国在多个地方也出现了氟胺酮滥用，广西、广东、江苏、福建、湖南、香港等地在缴获物、污水及尿液样品中检出了氟胺酮[2，8-11]。国内外氟胺酮滥用日趋严重，但关于该物质的药理学研究甚少。氟胺酮主要作用于神经系统和心血管系统，如幻觉、意识丧失、抽搐、运动抑制、高血压、心动过速，部分会出现呼吸抑制、恶心呕吐、肝肾功能紊乱等[11-12]，其作用机制尚不清楚。研究表明[3，13]，氟胺酮的麻醉作用类似于氯胺酮，有效剂量和苏醒时间均优于氯胺酮，但文献均未给出具体实验数据。本研究对氟胺酮的急性毒性和神经毒性进行研究，并与常见毒品氯胺酮进行了比较，以期为氟胺酮的滥用防治及相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞

健康SPF 级ICR 雄性小鼠，体重为18～22 g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。饲养环境：温度控制在25±1 ℃，湿度维持在50%±10%，采用12 h 人工光照明暗交替。实验动物在动物房适应性饲养至少2 d，可自由摄食饮水。SH-SY5Y、PC12 和SN4741 细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。对实验动物进行的操作均符合实验动物伦理学，遵循国家动物使用和保护委员会颁布的相关条例。

1.2 仪器与试剂

多功能酶标仪，美国Thermo Scientific 公司；氟胺酮和氯胺酮，纯度均大于98%，由公安部禁毒情报技术中心提供；0.9%氯化钠注射液，石药银湖制药有限公司；细胞分化诱导剂视黄酸，Merck 公 司；3-（4，5- 二 甲 基 噻 唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT），Merck 公司；十二烷基硫酸钠（SDS），国药集团化学试剂有限公司。MTT 溶 液：用PBS 配 成5 mg/ml；SDS 溶液：10%的SDS 溶液用1 mol/L 盐酸溶液调整pH至2。

1.3 小鼠急性毒性实验

采用“上下法”测定氟胺酮和氯胺酮的小鼠急性毒性，给药方式包括灌胃给药、皮下给药、腹腔给药和尾静脉给药4 种方式。灌胃给药、腹腔给药、皮下给药以500 μl 固定体积，尾静脉给药以200 μl 固定体积。起始剂量低于半数致死量（median lethal dose，LD50）的估计值，在AOT425 StatPgm 软件的指示下对实验小鼠逐只给药，剂量级数因子为1.32，在实验中剂量级数因子保持不变；给药后观察2 d，如果 2 d 后动物死亡，则降低剂量；如果2 d 后动物仍存活，则增加剂量。实验结果通过软件的计算可得到该种给药方式下小鼠的LD50值及95%置信区间。

1.4 神经细胞毒性实验

取对数生长期的细胞，用酶分散法制备成细胞悬浮液。用细胞培养液稀释细胞悬浮液，调整浓度至1×105个细胞/ml，于96 孔细胞培养板内接种每孔100 μl。37 ℃，5% CO2条件下培养24 h。取出96 孔细胞培养板，加入细胞分化诱导剂后继续培养2 d。培养2 d 后，随机分成氟胺酮组和氯胺酮组，氟胺酮组加入不同浓度（0.1、0.3、1、3、10 mmol/L）氟胺酮，氯胺酮组加入不同浓度（0.1、0.3、1、3、10 mmol/L）氯胺酮，每个浓度设置3 个重复孔。取出96 孔细胞培养板，弃去培养液后，每孔加入100 μl 的氟胺酮或氯胺酮，加样后继续培养24 h。终止培养前避光向每孔加入 10 μl MTT 溶液，摇匀置于37 ℃培养箱继续孵育4 h 后，再向每孔加入100 μl SDS 溶液，37 ℃孵育20 h。用酶标仪检测 570 nm 波长下每孔的吸光度（optical density，OD）值。结果以3 个复孔的均值表示，按公式计算细胞的存活率：细胞存活率（%）=OD1/OD2×100%。其中OD1表示给药组的平均吸光度值，OD2表示阴性对照的平均吸光度值。最后通过氟胺酮和氯胺酮的浓度-反应曲线的非线性拟合，获得氟胺酮和氯胺酮的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.5 统计方法

小鼠急性毒性实验通过AOT425 StatPgm 软件进行计算得到小鼠4 种不同给药方式的LD50值和95%置信区间。神经细胞毒性实验通过MTT 实验数据绘制得到氟胺酮和氯胺酮的浓度-反应曲线，对其反应曲线方程进行非线性拟合，从获得的方程式中计算氟胺酮和氯胺酮的IC50值。

2 结果

2.1 小鼠急性毒性实验结果

氟胺酮的小鼠4 种给药方式LD50值大小顺序与氯胺酮的一致，其顺序为尾静脉给药＜腹腔给药＜皮下给药＜灌胃给药。氟胺酮和氯胺酮的LD50均 值 分 别 为294.00 mg/kg 和241.78 mg/kg。氟胺酮和氯胺酮通过4 种不同给药方式所得小鼠LD50值、95%置信区间结果见表1。

表1 氟胺酮和氯胺酮4 种不同给药方式的小鼠实验结果[LD50（95%置信区间），mg/kg]

2.2 神经细胞毒性实验结果

氟胺酮与氯胺酮对三种细胞系的IC50值大小顺序一致，其均值分别为14.57 mmol/L和4.55 mmol/L，实验结果见表2 和图1。

图1 氟胺酮和氯胺酮诱导SH-SY5Y 细胞、PC12 细胞、SN4741 细胞的死亡

表2 氯胺酮和氟胺酮的神经毒性[IC50（95%置信区间），mmol/L]

3 讨论

3.1 急性毒性比较

急性毒性实验结果通常用LD50值来反映，LD50值越小说明毒性越大。目前文献中关于氯胺酮的急性毒性报道较多，有文献报道小鼠腹腔给药氯胺酮的LD50值约为360 mg/kg，是苯环利啶的4.65 倍[14]，另一篇文献报道了啮齿类动物的灌胃给药氯胺酮的LD50均值约为600 mg/kg[15]。氟胺酮与氯胺酮的化学结构高度相似，是在保持氯胺酮总体构架不变的基础上，仅用氟原子代替了氯原子，但目前尚没有关于氟胺酮的急性毒性数据报道。法国首例氟胺酮相关致死案例，在死者外周血、尿液、胆汁和玻璃体液均检出了氟胺酮，推断致死原因是同时摄入氟胺酮（主要因素）、3-MeO-PCE、5-MeO-DMT、安非他明和可卡因的“鸡尾酒效应”导致的呼吸抑制[16]。本文对氟胺酮和氯胺酮进行了4 种不同给药方式的小鼠急性毒性评估。因氟胺酮和氯胺酮主要以鼻吸或口服形式滥用，而鼻吸主要是通过呼吸区的丰富毛细血管进入体循环，吸收速度接近静脉注射，灌胃给药是通过胃黏膜等方式间接吸收入血。因此本实验中的小鼠尾静脉注射给药方式可一定程度上模拟人鼻吸给药，而灌胃给药则可模拟人的口服给药。实验结果显示，氟胺酮的小鼠4 种给药方式LD50值分别为尾静脉给药92.57 mg/kg、腹腔给药231.00 mg/kg、皮下给药365.90 mg/kg、灌胃给药486.5 mg/kg，其大小顺序与氯胺酮的一致，依次为尾静脉给药＜腹腔给药＜皮下给药＜灌胃给药，说明这两种物质的急性毒性均是尾静脉给药毒性最大，灌胃给药毒性最小，同时也间接说明了不同滥用形式对氟胺酮和氯胺酮滥用者的危害程度具有不同的影响。氯胺酮的腹腔给药和灌胃给药的急性毒性数据（LD50）与文献报道相近[14-15]。氟胺酮和氯胺酮的小鼠4 种给药方式的LD50均值分 别 为294.00 mg/kg 和241.78 mg/kg，以 小 鼠4种给药方式的LD50均值为标准，氟胺酮的急性毒性作用为氯胺酮的82.24%。

3.2 神经毒性比较

绝大部分新精神活性物质具有明显的神经毒性，国际公认神经毒性数据是评估新精神活性物质危害性的关键性指标[17]。NMDA 受体拮抗剂在不同动物体内均能产生神经毒性，表现为神经元或轴突的退行性变及区域性脑细胞死亡[18]。研究发现[19-20]，苯环利啶和MK-801 可诱导大鼠后扣带回皮质和压后皮质出现神经病理学变化或损伤，这种变化可能是神经元胞浆空泡化，后来被证实是胞质空泡化（如内质网、线粒体肿胀或破裂）。本研究通过对具有多巴胺能神经元特征的SH-SY5Y、PC12 和SN4741 细胞系进行实验，采用MTT 法检测氟胺酮的神经细胞毒性作用，并与氯胺酮比较，结果显示氟胺酮对SH-SY5Y、PC12 和SN4741 三 种 细 胞 系 的IC50值 依 次 为7.91 mmol/L、17.63 mmol/L 和18.18 mmol/L，与氯胺酮的IC50大小顺序一致，说明两种物质均对SH-SY5Y 细胞毒性作用最大，对SN4741 细胞毒性作用最小。冰毒是我国滥用人数最多的毒品，有研究对冰毒的神经毒性进行了研究，结果发现冰毒对SH-SY5Y、PC12 和SN4741 三种细胞系的IC50值依次为5 mmol/L、2 mmol/L 和 4 mmol/L[17]。以IC50均值为标准，氟胺酮的神经毒性为氯胺酮的31.23%，是冰毒的25.17%。这些结果发现，氟胺酮的神经毒性比常见毒品冰毒和氯胺酮的神经毒性都低，这可能是其滥用呈上升趋势的原因之一。

3.3 总结

综上所述，氟胺酮与氯胺酮具有一样明显的急性毒性和神经毒性。氟胺酮的急性毒性为氯胺酮的82.24%，神经毒性为氯胺酮的31.23%。尽管实验结果显示氟胺酮的毒性作用小于氯胺酮，但考虑到近年来氟胺酮在我国滥用人数的急剧增加及快速蔓延趋势，其危害性不容忽视。