作物异源附加系创建方法及应用

禄小溪 孟珊 沈新莲 王凯

摘要：异源附加系是克服植物远缘杂交障碍和开展遗传研究的中间材料，可用于基因定位、构建外源渐渗系群体、创新种质资源、开展外源染色体配对和重组等研究。着重阐述了构建作物异源附加系的常规法、桥梁法、双重单体或多重单体附加法、单倍体法、回交法、细胞融合法、自交法，对异源附加系的形态学鉴定、原位杂交、细胞学鉴定、分子标记鉴定方法和异源附加系在基因定位、种质资源创新的应用等方面的研究进展，对异源附加系的研究现状进行了总结，以期为作物野生资源的利用提供参考。

关键词：异源附加系;染色体;野生种;种质资源创新

中图分类号：S330;S334 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）05-0010-06

收稿日期：2021-04-29

基金项目：国家自然科学基金（编号：31801047）。

作者简介：禄小溪（1996—），女，河南郑州人，硕士研究生，主要从事棉花分子育种研究。E-mail：lupeixuan357@gmail.com。

通信作者：王 凯，教授，主要从事作物分子细胞遗传学研究。E-mail：kwang5@126.com。

1个（或1对）异源染色体被添加到另一个物种的染色体组中，被称为异源附加系[1]。根据作物细胞中附加的异源染色体的个数，异源附加系可以分为单体异源附加系（monosomic alien addition lines，简称MAALs）、双体异源附加系（disomic alien addition lines，简称DAALs）、多体异源附加系（multiple alien chromosomes alien lines，简称MACALs）等。单体异源附加系：附加了1条异源染色体的附加系;双体异源附加系：附加了1对异源染色体的附加系;多体异源附加系：附加了3条及3条以上异源染色体的附加系。MAALs的构建己经在一些作物中完成，并且已经应用到作物育种和遗传基础研究中，其中一部分单体异源附加系己经在小麦[2-7]、水稻[8]、大豆[9-10]、燕麦[11-12]、棉花[1，13-17]、玉米[18-19]、烟草[20]、甘蓝[21]等中被构建。

1 异源附加系构建方法

异源附加系的几种主要构建方法：常规法、桥梁法、双重单体或多重单体附加法、单倍体法、细胞融合法等。

1.1 常规法

常规法是目前构建异源附加系最经典也是应用最广的方法，通过种间或属间杂交获得杂种F1，并通过秋水仙素加倍F1产生双二倍体，将双二倍体与1个亲本回交数代，得到单体附加系、双体附加系、多体附加系。OMara通过此常规法得到了小麦-黑麦异源附加系[22]。Shigyo等利用此方法获得了一套完整的日本大葱（Allium fistulosum L.）-小洋葱（A. cepa L. var. aggregatum）单体异源附加系[23]。Singh等利用短绒野大豆（2n=78）與栽培大豆（2n=40）杂交后使用此方法获得了一系列异源单体附加系和异源二体附加系[10]。李鹏飞将白菜型油菜（AA）与黑芥（BB）杂交产生F1（AB），再使用秋水仙素加倍F1的染色体数，使其成为芥菜型油菜（AABB），后再与白菜型油菜（AA）回交，获得了白菜型油菜-黑芥异源附加系[24]。Chen等通过澳洲棉与陆地棉杂交，用此方法构建了一套完整的13个陆地棉-澳洲棉附加系，其中有11个单体异源附加系和2个多体异源附加系[14]。Meng等利用异常棉与陆地棉杂交，用此方法并结合SSR分子标记技术，鉴定出一整套13个陆地棉-异常棉单体异源附加系[17]。

1.2 桥梁法

桥梁法是指当2个亲本由于亲缘关系较远时，造成杂交不亲和时，先利用与2个亲本较易成功杂交的中间材料作为桥梁亲本，再按照常规法选育出所需要的异源附加系。栗根义等利用由人工合成的甘蓝型油菜作为桥梁材料，选育出白菜-甘蓝异源附加系[25]。Chetelat等利用番茄野生种（Solanum lycopersicoides Dun.）与番茄栽培种（Lycopersicon esculentum Mill.）杂交后产生F1，再以潘那利番茄（L. pennellii）衍生的桥梁品系与F1杂交，获得一系列异源附加系，克服了F1与栽培番茄回交的不育和不相容性障碍[26]。王红林用四倍体玉米（2n=40）、四倍体指状摩擦禾（2n=72）、四倍体多年生大刍草（2n=40）远缘杂交创制出异源近六倍体 MTP-1（2n=74），再以该异源近六倍体为桥梁材料与玉米进行回交，在BC3代获得2个玉米-大刍草单体异源附加系[18]。

1.3 双重单体或多重单体附加法

双重单体或多重单体附加法是指通过利用双重单体、多重单体异源附加系自交，产生二体异源附加系的方法，解决了单体异源附加系自交产生二体异源附加系频率低的问题。吕文欣等利用附加了结球甘蓝1号和6号染色体的大白菜双单体异源附加系为材料，从其自交后代的38个植株中，筛选出3株大白菜-结球甘蓝1号染色体二体异源附加系[27]。杨晓菲利用普通小麦-滨麦抗条锈病的双单体附加系（2n=44=42T.a+L.m2+L.m3）其中，T.a代表小麦染色体;L.m2表示滨麦第2部分同源群染色体，L.m3表示滨麦第3部分同源群染色体）进行自交，在自交后代中筛选出含有一对L.m2滨麦染色体的普通小麦-滨麦的二体异源附加系[28]。

1.4 单倍体法

指对远缘杂种F1或倍半二倍体的花药或者子房进行组织培养，获得染色体组成为（n+1）的单倍体植株，再经过染色体加倍，可获得双体异附加系，缩短育种时间。张永泰等对甘蓝型油菜-白芥单体异源附加系进行小孢子培养，获得单倍体植株后，用秋水仙素加倍单倍体植株的染色体数，获得双体异源附加系[29]。Wang等通过组织培养甘蓝型油菜-海甘蓝单体异源附加系的小孢子，再利用秋水仙素加倍其染色体，得到了甘蓝型油菜-海甘蓝双体异源附加系[30]。

1.5 回交法

1.5.1 回交、自交法

使不同染色体倍数的2个亲本杂交后，使F1与其中1个亲本进行回交后再自交得到异源附加系的方法。西北农林科技大学农学院染色体工程实验室通过中国春与卵穗山羊草SY159杂交得到F1后与中国春回交，再进行连续自交，Wang等从该杂交的BC1F6群体中筛选出7Mg二体附加系[31];龙得雨等从该杂交的BC1F8群体中鉴定出的其衍生后代1003，是抗白粉病和条锈病的小麦-卵穗山羊草二体异源附加系[4]。Song等通过普通小麦与欧山羊草（Aegilops biuncialis）的远缘杂交获得F1，F1植株以普通小麦为雄性亲本连续回交2次，然后自交，最终获得小麦-欧山羊草Ae. biuncialis 5Mb二体异源附加系[32]。

1.5.2 倍半二倍体回交法

不同染色体数目的2个亲本杂交后，产生的F1为拥有其中1个亲本的全部染色体，另1个亲本的半数染色体的倍半二倍体，使F1再与其中1个亲本回交产生附加系的方法。Suen等将皱叶烟草（Nicotiana plumbaginifolia，PP，2n=20）和美花烟草（N. sylvestris，SS，2n=24）杂交，获得的F1倍半二倍体（PPS，2n=32）与亲本皱叶烟草回交，最终获得了皱叶烟草-美花烟草异源附加系[20]。郑宝智等利用大白菜-结球甘蓝异源三倍体（AAC，2n=3x=29）与亲本大白菜（AA，2n=2x=20）进行回交，从BC1、BC2回交世代自交的后代中，获得附加了甘蓝9号染色体的大白菜-甘蓝单体异源附加系植株[33]。谭晨等利用甘蓝（CC，2n=18）与黑芥（BB，2n=16）杂交获得了三倍体杂种（CCB，2n=26），以其为母本与甘蓝连续回交3代，获得了7种甘蓝-黑芥异源附加系[21]。

1.6 细胞融合法

又名原生质体融合法，指不能直接进行有性杂交的植物体细胞，去掉其细胞壁后成为原生质体，再诱导2个原生质体互相融合形成异核体，异核体生出细胞壁后，再进行有丝分裂时会发生核融合，从而实现体细胞杂交，最后获得杂交种，使杂交种植株与亲本回交，可以获得异源附加系，有效解决了难题，实现了亲缘关系远的物种遗传物质的转移。Ali等使用马铃薯-番茄体细胞杂交种与亲本马铃薯进行回交，在马铃薯背景中建立完整的外源番茄染色体附加系，筛选出5种马铃薯-番茄异源单体附加系和1种二体附加系[34]。Kang等利用甘蓝型油菜（AACC，2n=38）与中国菘蓝（II，2n=14）的体细胞杂交获得杂种（AACCII，2n=52），使杂种再与甘蓝型油菜回交，获得32株异源单体附加系[35]。王桂香等将花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis）与黑芥叶肉原生质体融合获得杂种，使杂种再与花椰菜进行回交，从后代中筛选出20份花椰菜-黑芥异源附加系[36]。丁力用甘蓝型油菜（AACC，2n=38）和诸葛菜（OO，2n=24）的体细胞杂种与甘蓝型油菜进行连续回交，在回交后代中获得了9种甘蓝型油菜-诸葛菜单体、二体异源附加系[37]。

1.7 自交法

自交法是指使不同染色体倍数的2个亲本杂交后，获得的后代再连续自交，从而获得异源附加系的方法。罗贤磊用硬粒小麦（AABB）与小偃麦8801（AABBEE）杂交得到F1后再连续自交，从自交后代中获得了分别附加了2E、4E染色体的硬粒小麦-长穗偃麦草单体异源附加系[38]。

2 附加系的鉴定

目前，鉴定异源附加系的主要方法：形态学鉴定、原位杂交、细胞学鉴定、分子标记鉴定等。

2.1 形态学鉴定

指能在杂种后代中被直接观察到的外观性状，如株型、花色、叶色、花药色、铃的形状、种子大小、抗病性等，而特定性状一般对应特定基因，因此通过肉眼观察到与栽培种不同的杂种后代的独特性状，可以初步判断植株是否携带异源染色体。形态学鉴定是检测植株是否含有异源染色体的最简单、最直接的方法，但是容易受到外部条件影响，因此需要和其他鉴定方法结合使用。周仲华通过叶片性状观察和分子标记检测，从陆地棉-索马里棉异源六倍体与陆地棉的回交后代中，鉴定出2个异源单体附加系[39]。任艳蕊等通过花瓣的特殊表型，在选育甘蓝-菜薹（CC+A）异源附加系时选育出染色体组成为（2n+1）的植株[40]。

2.2 原位杂交

原位杂交是指将特定标记的已知核酸序列为探针，用探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸进行精确定位的过程。原位杂交一般在细胞标本或组织标本上进行。鉴定附加系常用的原位杂交技术有2种，先发展的是荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，简称FISH）技术，在其发展的基础上又建立了基因组原位杂交（genomic in situ hybridization，簡称GISH）技术。FISH技术是发展于20世纪80年代末的新技术，以放射性原位杂交技术为基础，以非放射性分子生物学和细胞遗传学相结合，是以荧光标记取代同位素标记的一种新型原位杂交方法。GISH技术是利用供体的基因组DNA作为探针，标记过的探针与外源特异序列结合，使外源染色体产生荧光杂交信号，进而使用荧光显微镜能直接观察到外源染色体或片段。张绍松等利用筛选出的分子标记检测和FISH技术，检测出了甘蓝型油菜-萝卜附加系附加的染色体在F2代中的遗传稳定性[41]。吴金华等利用细胞学、GISH技术鉴定了普通小麦-黑麦1R双体异附加系抗白粉病品系的黑麦遗传物质[42]。

2.3 细胞学鉴定

细胞学鉴定主要包括核型分析（配对行为、染色体数目、着丝粒位置等）和染色体分带（C-带、N-带等）。根据核型分析确定染色体组成情况，但无法区分哪一条是外源染色体;染色体分带利用C-带技术区分染色体。任晓琴等根据花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ染色体配对情况及染色体C-分带，在中国春-大赖草杂种回交后代中选育出稳定的二体异源附加系[43]。高东杰等通过利用细胞学技术，观察到栽培甜菜-白花甜菜单体异源附加系有丝分裂中期的染色体核型，计算出附加的染色体长度与栽培甜菜染色体长度的比值（简称染色体比值），用以鉴别单体附加系类别[44]。袁世峰等应用植物细胞学方法，通过对甘蓝型油菜与埃塞俄比亚芥种间杂种衍生后代的根尖细胞染色体数的鉴定，以及花粉母细胞减数分裂染色体行为的观察，鉴定出甘蓝型油菜B组染色体附加系[45]。

2.4 分子标记

DNA分子标记指可遗传并可检测的DNA序列，它在DNA水平上直接反映个体的遗传变异，具有简单、迅速、准确的特点，在识别异源染色体和鉴定异附加系上得到了广泛应用。郭长虹等筛选出杀配子染色体特有的RAPD标记，并检测普通小麦与3种山羊草之间的RAPD多态性，鉴定了3个中国春具杀配子染色体的双体异源附加系及作为3个杀配子基因种源的3种山羊草[46]。张丽等成功将AFLP标记转化为更稳定、操作更简单的序列标记位点（STS）标记，这些标记可用于小麦-长穗偃麦草异源附加系中长穗偃麦草遗传物质的检测[47]。Edet等使用PCR和DArTseq SNP标记筛选出10个小麦-滨麦异附加系，其中有4个单体附加系和6个双体附加系，表明适当的分子标记可在不进行原位杂交的情况下生产和鉴定小麦异源附加系，从而节省了大量时间和精力[48]。Hechanova等利用野生稻（Oryza rhizomatis）特异性的InDel标记结合形态学和细胞学，鉴定出一套完整的栽培水稻-野生稻单体异附加系[49]。Tan等通过SSR标记和FISH技术相结合，得到7个附加了不同B基因组染色体的甘蓝-黑芥单体异源附加系和1个带有B2染色体的三体附加系[50]。Zhou等通过RAPD分子标记与细胞学和形态学相结合，分析鉴定出2个陆地棉-索马里棉单体附加系，对棉花改良有重要意义[1]。Sarr等使用SSR分子标记和基因组原位杂交，鉴定出5个新的陆地棉-澳洲棉单体异源附加系[13]。Chen等利用SSR分子标记技术，鉴定出13个陆地棉-澳洲棉附加系[14]。Chen等使黄瓜栽培种与野黄瓜进行杂交，利用RAPD标记与细胞学，鉴定出2个栽培黄瓜-野黄瓜单体附加系[51]。

3 附加系的应用

由于异源附加系附加的是整条或多条染色体，因此不仅会转入优异的基因，同时也会转入许多不利的基因。因此，异源附加系一般作为桥梁亲本用于基因定位、构建外源渐渗系群体（染色体文库）、促进种间优异基因的渐渗等。

3.1 基因定位

一套完整的单体异源附加系把供体亲本的基因组分为单个染色体，每条染色体都处于相同的受体亲本遗传背景下，因此供体基因组内染色体间的相互影响被消除，可将一些显性性状定位到特定染色体上，利用分子标记可以把相应的基因定位到染色体上。Li等通过GISH技术和特异性位点扩增片段测序（SLAF-seq）对小麦-冰草（Agropyron cristatum）衍生系5113进行鉴定，证明是1个新型的小麦-冰草二体6P附加系。与其亲本Fukuho相比，5113表现出多种优异农艺性状，包括最上部节间/株高比更高、旗叶更大、穗长更长、每穗粒数和每穗小穗数增多、中穗粒数增多、每株可育分蘖数增多、抗白粉病和叶锈病能力增强。利用SLAF-seq标记分析Fukuho与5113杂交产生的双亲群体（F1、BC1F1和BC1F2群体），将这些优异性状的基因定位在冰草6P染色体上[52]。王丹利用分子标记辅助选择（marker assisted selection，简称MAS），综合GISH和FISH技术分析，鉴定出一套辉县红-荆州黑麦异附加系。再利用22个6R专化标记进行染色体臂定位，结果表明，荆州黑麦6RL携带有高抗白粉病基因[53]。王文泉利用反复干旱法对整套小麦-冰草二体附加系的抗旱性进行鉴定，结果表明，冰草的抗旱性可能涉及较多的基因位点，单个附加系的抗旱性均弱于冰草，抗旱基因主要分布在2P、4P、6P和7P染色体上;对小麦-冰草二体附加系抗寒性的鉴定表明，多基因控制的抗寒基因主要分布于冰草的4P和6P染色体上[54]。Meng等对构建出的一套13个陆地棉-异常棉单体附加系进行表现性状调查，并与陆地棉进行对比，发现附加了3B染色体的MAAL比陆地棉亲本有明显高的纤维强度和低马克隆值，分别附加了8B和9B染色体的MAAL的纤维强度也明显高于陆地棉亲本，表明异常棉的3B、8B、9B染色体可能包含赋予改善纤维强度和细度的基因[17]。Chen等将构建的12个陆地棉-澳洲棉单体附加系与亲本陆地棉相比较，发现附加了3Ga染色体的MAAL有非常高的衣分百分比和正常的纤维长度，表明澳洲棉的3Ga染色体可能具有控制种子指数的基因;附加了8Ga染色体的MAAL叶片具有高浓度的叶绿素a和叶绿素b，表明澳洲棉的8Ga染色体可能包含提高叶绿素含量的基因[14]。

3.2 种质资源创新

培育异源附加系的最终目的就是把野生种的有利基因渐渗入栽培种的基因组中，从而改良栽培种。异源附加系由于基因组不稳定，在育种中很难直接利用，因此需要作为中间桥梁材料，通过同源重组、辐射、杀配子等方法，构建一系列异代换系、易位系、渐渗系等，从而实现将野生种优异基因更好地导入栽培种。发展成套MAALs将为外源物种基因组和遗传学研究提供了一种新型工具[11]。

异源附加系在不同的作物中应用广泛，在小麦中报道最多。张雅莉等采用1200 R 60Co-γ射线处理的小麦-大赖草二体附加系DA7Lr的花粉授予已去雄的普通小麦中国春，获得了具有1条普通小麦-大赖草易位染色体的植株，为小麦抗赤霉病遗传改良提供了新种质[55]。刘淑会等利用“缺体回交法”以小大麦二体异源附加系WBA9816作父本与阿勃缺体小麦杂交，创制小大麦异代换系，F1再用该异源附加系回交，回交后代通过细胞学鉴定，筛选出2n=43的双单体植株进行套袋自交，从自交后代群体培育出WBS02126，田间试验结果显示，WBS02126表现弱春性、叶片宽厚上挺、叶色淡绿、棒状穗、小穗排列紧密、长芒、早熟、综合抗病性好[56]。

在水稻中，赵庆华采用源于乌干达的紧穗野生稻（O. eichingeri，CC，2n=24）與栽培稻02428（O. sativa L. japonica，AA，2n=24）杂交，从其后代中筛选出附加了第11号染色体的异源染色体单体附加系。利用该单体附加系，通过体细胞无性繁殖获得一个无性系群体，利用SSR分子标记鉴定出了渐渗系群体，并筛选出一些有明显性状变化的渐渗材料[57]。Hechanova等获得了栽培水稻-野生稻单体异附加系衍生的二体渐渗系，一些渐渗系表现出对褐飞虱和绿叶蝉的抗性[49]。唐明等利用一个嵌合型栽培稻-药用野生稻7号染色体单体附加系与栽培稻回交，获得了渐渗了药用野生稻染色体片段的回交后代，渐渗片段改变了回交后代的株高、千粒质量、结实率、叶宽等质量性状[58]。

在番茄中，Mangat等獲得由番茄-类番茄单体附加系衍生的渐渗系，该渐渗系在形态学上更像栽培番茄，但出现了与栽培番茄及单体附加系缺乏的新表型，表明该渐渗系捕获了新的遗传变异，其中2个渐渗系表现出了耐旱性[59]。

在油菜中，丁力用表型为锯齿叶的甘蓝型油菜-诸葛菜附加系与甘蓝型油菜缺体（2n=36）杂交，获得也表现为锯齿叶的代换系[37]。Li等对甘蓝型油菜-菘蓝单体附加系的自交后代进行筛选，获得一个具有良好雄性育性的含有少量菘蓝来源的DNA片段的双单倍体恢复系，该恢复系对花粉和种子育性以及低硫代葡萄糖苷含量有很大改善[60]。

4 展望

异源附加系是将野生近缘物种的优异基因转入栽培种中的桥梁材料，由于附加系染色体数目的非整倍性，使得基因组并不稳定，在育种中很难直接利用，因此需要通过同源重组、杀配子、辐射等方法进一步构建渐渗系、易位系等种质资源。但异源单体附加系（MAAL）是在栽培种完整的基因组背景下，添加了1条外源染色体的情况，可以以栽培种为对照组，研究供体亲本的单个染色体。这对一些显性性状基因在染色体上的定位更有优势，能使定位更快更精准。进行基因定位后，更能进一步构建单个外源染色体的渐渗文库，为未来的育种工作和基因功能研究提高效率。

目前，关于异源附加系的构建研究已经在多种作物中实现，但大部分研究进行的都是种间杂交，只有少数几个科创建了属间杂交异源附加系，如十字花科芸薹属甘蓝型油菜和诸葛菜属诸葛菜的异源附加系的创建[37];禾本科燕麦属燕麦和玉蜀黍属玉米附加系的创建[19];茄科茄属马铃薯和番茄属番茄附加系的创建等[34]。未来育种工作者们可以扩大杂交范围，尝试进行更多的属间杂交，拓宽作物栽培种遗传多样性。附加系的应用方面研究还主要集中在小麦、水稻等少数几个作物上，在其他农作物和蔬菜等作物上的研究相对较少，今后要进一步加强对不同作物中附加系应用的研究，对作物育种领域有重要意义。

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