淫羊藿药材中主要黄酮类成分含量对比研究

韩 莹

淫羊藿又称仙灵脾等，是中医学中常用的一味补益药，能够发挥补肝肾、强筋骨、祛风湿等功效。现代药理药效学研究已经表明，淫羊藿中所含有效成分，可以发挥调节机体免疫功能、调节血压、延缓衰老以及改善机体微循环等作用，临床应用较为广泛[1-3]。在目前的药材质量标准控制中，《中华人民共和国药典·一部》[4]规定淫羊藿药材主要成分包括宝藿苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷，而有文献报道显示[5-7]，淫羊藿中某些成分的含量超过了淫羊藿苷，因此本次研究收集了几个不同品种的淫羊藿药材，以反相高效液相色谱法(RP-HPLC)为含量测定方法，以金丝桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ这6种黄酮类成分为主要测定指标，检测并统计分析不同淫羊藿品种中6种黄酮类成分的差异性，以期为淫羊藿药材的质量标准制定、资源利用等方面提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 主要检测仪器Waters高效液相色谱仪、循环真空水泵、超声波清洗器、电子分析天平。

1.2 试药淫羊藿苷(批号：MUST-11100145)、金丝桃苷(批号：MUST-11122003)、朝藿定A (批号：MUST-11062311)、朝藿定B (批号：MUST-11062312)、朝藿定C (批号：MUST-11062313)、宝藿苷Ⅰ(批号：MUST-11200815)，以上试药均购自成都曼思特生物科技有限公司。5种品种淫羊藿药材分别购自吉林临江、贵州沿河、重庆南川、重庆巫溪、四川北川，经鉴定分别为朝鲜淫羊藿、柔毛淫羊藿、箭叶淫羊藿、腺毛淫羊藿、粗毛淫羊藿的干燥地上部分。

2 方法

2.1 溶液的制备①对照品溶液的制备：精密称取各种对照品适量，加甲醇1 ml，得到6种对照品溶液如下：金丝桃苷0.230 mg/ml、朝藿定A 0.712 mg/ml、朝藿定B 1.026 mg/ml、朝藿定C 0.470 mg/ml、淫羊藿苷0.597 mg/ml、宝藿苷Ⅰ 0.533 mg/ml。②供试品溶液的制备：取药材粉末约0.3 g，精密称定后置于具塞的锥形瓶中，加入25 ml稀乙醇溶液，称定重量后超声处理1 h，然后冷却至室温，再次称定重量，用同等浓度的稀乙醇补充减失的重量，充分摇匀后过滤，取续滤液20 ml并挥干溶剂，加少量甲醇溶解后，将其转移至2 ml的容量瓶中，稀释至刻度，以0.45 μm微孔滤膜滤过即得。

2.2 色谱条件色谱柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-纯水(B) 梯度洗脱(0→12 min→30 min→45 min→65 min，18% A→25% A→27% A→51% A→70% A)；流速：1.0 ml/min；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃。在此条件下金丝桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ均能达到基线分离。HPLC见图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察分别精密量取对照品溶液各1 ml，置于10 ml容量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度并充分摇匀，即为混合对照品溶液。分别精密吸取2 μl、5 μl、10 μl、15 μl、20 μl和25 μl，注入液相色谱仪测定，以进样量为X，峰面积为Y，拟回归方程。

2.3.2 精密度取混合对照品溶液连续进样6次，以峰面积为指标考察仪器的精密度。

2.3.3 稳定性取同一供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h分别进样20 μl，测定样品的稳定性。

2.3.4 重复性取同一批样品6份，制备供试品溶液，测定其重复性。

2.3.5 加样回收率精密称取已知含量的同一批样品6份，加入一定量的对照品，按样品处理方法制备并进样测定，计算各对照品的加样回收率。

2.4 样品含量测定照上述供试品溶液处理方法及HPLC测定条件对不同品种淫羊藿药材进行处理和测定。

3 结果

3.1 线性关系淫羊藿中6种黄酮类成分的回归方程及相关系数(r)分别为：金丝桃苷：Y=17.863X+3.469(r=0.999 7)，线性范围4.6～57.5 μg/ml；朝藿定A：Y=37.546X+1.825(r=0.999 8)，线性范围14.2～177.9 μg/ml；朝藿定B：Y=19.676X+3.026(r=0.999 8)，线性范围20.5～256.7 μg/ml；朝藿定C:Y=26.249X+1.876(r=0.999 7)，线性范围9.4～117.5 μg/ml；淫羊藿苷Y=23.473X+1.642(r=0.999 9)，线性范围11.9～149.2 μg/ml；宝藿苷ⅠY=21.771X+2.596(r=0.999 8)，线性范围10.7～133.3 μg/ml。

3.2 精密度结果显示金丝桃苷对照品峰面积的RSD为1.54%、朝藿定A为1.89%、朝藿定B为1.78%、朝藿定C为1.25%、淫羊藿苷为1.71%、宝藿苷Ⅰ为1.08%。

3.3 稳定性结果显示24 h内供试品溶液中金丝桃苷峰面积的RSD为1.90%、朝藿定A为1.83%、朝藿定B为1.65%、朝藿定C为1.94%、淫羊藿苷为1.62%、宝藿苷Ⅰ为1.91%。

3.4 重复性结果显示6份样品中金丝桃苷的平均含量为1.70 mg/g，RSD为1.75%；朝藿定A的平均含量为3.78 mg/g，RSD为1.98%；朝藿定B的平均含量为6.16 mg/g，RSD为1.51%；朝藿定C的平均含量为2.57 mg/g，RSD为2.09%；淫羊藿苷的平均含量为10.87 mg/g，RSD为2.33%；宝藿苷Ⅰ的平均含量为2.10 mg/g，RSD为1.34%。

3.5 加样回收率结果显示金丝桃苷的平均加样回收率为101.25%，RSD为1.53%；朝藿定A的平均加样回收率为98.90%，RSD为1.09%；朝藿定B平均加样回收率为100.33%，RSD为1.96%；朝藿定C平均加样回收率为100.46%，RSD为1.11%；淫羊藿苷平均加样回收率为99.32%，RSD为1.64%；宝藿苷Ⅰ平均加样回收率为99.02%，RSD为1.90%。

3.6 样品含量测定不同品种淫羊藿药材中6种黄酮类成分含量测定结果。见表1。

表1 不同品种淫羊藿药材中6种黄酮类成分含量测定结果

4 讨论

淫羊藿的药用来源种类繁多，且淫羊藿药材受产地、品种的影响，造成不同品种间的成分相差较大，史万忠等[8]分析了不同产地、不同品种的30批市售淫羊藿药材，发现部分药材中的某个成分的含量并未达到《中华人民共和国药典·一部》[4]所规定的质量标准。而裴利宽[9]研究了近10年淫羊藿药材及饮片的质量，发现大部分箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿的淫羊藿苷和总黄酮含量均达不到标准，建议《中华人民共和国药典·一部》从新增饮片质量标准中去除箭叶淫羊藿饮片和巫山淫羊藿饮片。有文献报道显示[10-12]，淫羊藿药材中所含金丝桃苷等5种黄酮类成分的生理活性较强。因此，从淫羊藿药材质量的整体把控考虑，应该对淫羊藿苷和其他黄酮类成分的含量共同测定，这样有利于更好地对淫羊藿的药材质量进行评估，更有利于合理利用药材资源。

本研究以淫羊藿中的金丝桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ这6种黄酮类成分作为测定指标，对比分析其在不同品种淫羊藿药材的含量差异。在对流动相的考察中，本研究对比了甲醇-纯水系统和乙腈-纯水系统对测定的影响，结果显示乙腈-纯水系统的分离度、峰形等色谱信息更优，故选用乙腈-纯水系统作为流动相系统。此外，本研究采用梯度洗脱程序，仅仅用了4个梯度比例变化就能将6种活性成分分离。在波长选择的考察中，中国药典及大量文献[13-18]报道选用波长270 nm测定淫羊藿中金丝桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ这6种成分含量，故本研究选用270 nm作为测定波长。而方法学考察结果也显示，本次方法线性范围较宽，精密度、重复性、稳定性、加样回收率均符合测定标准要求，可以作为淫羊藿药材中6种黄酮类成分的含量测定方法。

本试验结果表明，淫羊藿药材受品种的影响较大，6种黄酮类成分的含量在其差异较大。只有朝鲜淫羊藿、粗毛淫羊藿中的淫羊藿苷含量达到《中华人民共和国药典·一部》规定的标准，箭叶和柔毛淫羊藿中则较低；粗毛淫羊藿、腺毛淫羊藿中朝藿定C含量明显高于淫羊藿苷，而柔毛淫羊藿中朝藿定B含量最高。因此，以多种黄酮类成分为指标来考察淫羊藿的质量更为科学、合理。

综上所述，本次研究中测定淫羊藿药材中金丝桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ成分的方法，不仅具有操作简便、高准确度以及良好的重复性好，而且测定时间较短，能够为完善淫羊藿药材的质量标准提供实验依据。