经PCI治疗急性ST段抬高型心肌梗死患者血浆的代谢组学研究

尹倩倩，李今朝

（锦州医科大学附属第一医院 心内科，辽宁 锦州121011）

急性ST 段抬高型心肌梗死（acute ST-elevation myocardial infarction, STEMI）是冠心病的严重类型，为致死致残的主要原因，其发病突然，进程凶险，转归难以预测，且发病率和病死率呈逐年上升趋势[1-2]。 经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention, PCI）是目前临床治疗STEMI 的首选方法之一[3]。但由于院前及院内等延误导致部分STEMI 患者再灌注不及时，术后仍有心律失常、心功能不全等心血管不良事件发生的风险，影响患者预后和转归。生物体受到内、外界刺激后，体内的代谢产物会发生变化，代谢组学就是通过分析内源性代谢物的变化来反映机体的状态。本研究旨在利用靶向代谢组学方法研究行PCI 治疗的STEMI 患者的血液代谢谱，筛选差异代谢物，探究与STEMI预后可能相关的标志物，为及早开通闭塞冠状动脉（以下简称冠脉）带来的获益提供代谢组学方面的依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2019年3月－2019年9月经急诊就诊于锦州医科大学附属第一医院诊断为STEMI，并行PCI治疗的患者43 例。STEMI 患者入选标准参照2019 版《急性ST 段抬高性心肌梗死诊断和治疗指南》[4]，排除标准：①有陈旧性心肌梗死病史，曾行冠脉搭桥术、溶栓治疗行补救性PCI 者；②风湿热、先天性心脏疾病、心肌炎、心肌病等其他心脏疾病者；③合并严重全身感染、脑血管疾病、风湿病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、骨关节病及肝、肾、造血系统等严重疾病者。本研究经医院医学伦理委员会审核，所有入选患者均自愿参与且签署知情同意书。

1.2 方法

《急性ST 段抬高性心肌梗死诊断和治疗指南》[4]提出120 min 内能完成PCI 治疗的首选PCI，否则应在首次医疗接触（first medical contact,FMC）30 min 内开始溶栓。本研究将＜120 min 完成PCI 的定义为A 组（20 例），＞120 min 未溶栓行PCI 治疗的定义为B 组（23 例）。记录两组患者院内及随访期间心血管不良事件发生情况与心脏彩超左室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）。分别于PCI术前、术后第2天、术后1 个月采指尖血，滴于专用采血滤纸上晾干后送检。

参照文献[5]进行样本预处理。将氨基酸内标和肉碱内标分别加入1 mL 纯甲醇，将这些同位素标准品混合在一起储存在4℃冰箱中，使用时再将其稀释100 倍作为工作溶液。每100 μL 工作溶液被分配到一个含有干血点样本（DBS）圆盘的孔中。在室温下轻轻摇动平板20 min，3 000 r/min 离心2 min，将滤液收集到新的96 孔平板中，每个平板中加入质量控制（QC）样本监测代谢组学分析测得数据的准确性。滤液和QC 溶液在50℃下用纯氮气干燥。每个干燥样品在60 μL 1-丁醇和乙酰氯的混合物（90∶10）中，65℃下衍生20 min。50℃下再次用纯氮气干燥衍生溶液。在代谢组学分析之前，将100 μL 流动相溶液加入到每个孔中。

最后进行代谢组学分析。在装有电喷雾电离（ESI）源的ABSCIEX 4000 QTrap 系统上进行直接进样质谱分析，并以正模式扫描。进样量、流速、质朴分析离子喷射电压、离子源气体压力等均参照文献[5]。共检测到23 种氨基酸、35 种肉碱、9 种氨基酸之间的比值、26 种肉碱之间的比值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 和SIMCA 14.1 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以例（%）表示，比较用χ2检验；患者的代谢组数据进行预处理后构建主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型，用Permutation 验证OPLS-DA 模型的有效性。差异代谢物根据VIP 值、VIP 置信区间、差异倍数进行筛选。

2 结果

2.1 STEMI 患者住院及短期随访期间（1 个月）心血管不良事件发生情况

两组患者住院时间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），A 组较B 组短；两组患者心衰和心律失常发生率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；A 组低于B 组；两组患者再发心肌梗死率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。既往文献显示心血管不良事件还应包括死亡[6-7]，本研究需抽取患者术后1 个月血液，因此该类患者除外。

表1 两组患者住院时间、心衰、心律失常、再发心肌梗死的比较

2.2 两组患者术后住院期间及术后1个月LVEF的比较

两组患者PCI 术后住院期间及术后1 个月随访时的LVEF 值比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），A 组均高于B 组。见表2。

表2 两组患者术后住院期间及术后1个月LVEF的比较（±s）

表2 两组患者术后住院期间及术后1个月LVEF的比较（±s）

组别A组n 20术后住院期间51.70±6.70术后1个月52.05±5.91 B组t 值P 值23 44.91±7.20 3.185 0.030 45.30±6.83 3.437 0.010

2.3 代谢轮廓对疾病状态的区分能力

PCA对两组患者入院时、术后第2天、术后1个月的血浆代谢物进行初步分析，得到3 个PCA 模型。A：入院时血浆代谢物无分离（见图1A）；B：术后第2 天代谢物有一定的区分趋势（见图1B）；C：术后1 个月时代谢物区分聚类趋势较明显（R2X =49.6%，Q2 =11.8%）（见图1C）。术后1 个月将患者的代谢物进一步构建OPLS-DA 模型，该模型能很好地区分A、B 两组患者，且模型有较好的拟合性和预测能力（R2Y =89.7%，Q2Y =74.2%）（见图2）。Permutation 实验证明OPLS-DA 模型是稳定的、有效的[截 距：R2 （0.0，0.441） Q2 （0.0，-0.518）]（见图3）。

图1 STEMI患者血浆代谢轮廓模型

图2 术后1个月时OPLS-DA模型

图3 Permutation实验

2.4 差异性代谢物的筛选

检测到的93 个代谢物及其含量值全部导入SIMCA 软件中，OPLS-DA 模型中筛选两组间变量重要性投影得分（VIP）＞1.0 代谢物（见图4），且排除系数图上置信区间包含0 的变量（见图5）；再结合差异倍数＜0.833 3 或≥1.2，最终筛选出14 个差异代谢物，见表3。将所选代谢物与患者术后1 个月LVEF 进行Spearman 相关分析，得出C5、C8、C10、C12、C14∶1、C16、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸与心脏LVEF 呈负相关（r=-0.316、-0.440、-0.322、-0.389、-0.414、-0.283、-0.375、-0.428 和-0.347，P=0.039、 0.003、 0.035、 0.010、 0.006， 0.041，0.047，0.004 和0.023）；C3、C4、C3DC、C5DC、苏氨酸与LVEF 无相关性（P＞0.05）。

图4 VIP图

图5 系数图

表3 A、B两组主要差异代谢物

3 讨论

近些年来，随着代谢组学的兴起，其逐渐成为生命科学不可缺少的研究领域。代谢组学通过对血、尿等进行检测、分析，对疾病发生、发展中伴随的生化变化有了全新的认识和了解，进而发现与疾病发生相关的生物标志物及病理分子机制，最终达到临床诊断、治疗的目的[8-9]。目前代谢组学被广泛应用于心血管领域。

早期、快速、完全地开通梗死相关动脉，可使缺血心肌迅速恢复血液灌注，进而挽救濒死心肌，降低心肌梗死危险程度，缩小心肌梗死面积，避免心脏构型发生改变[10]及维持心功能是STEMI 患者预后的关键[4]。本研究A 组患者发病至冠状动脉开通时间短（≤2 h），心功能接近正常，心血管不良事件发生较B 组低，与已有报道一致[6，11]。由于本研究样本量偏少，且随访时间相对较短，再发心肌梗死率在两组间无差异。由于心衰是STEMI 最常见的并发症，也是最重要的预后不良指标之一[12]，而LVEF 是诊断心衰的标准之一，因此又对两组患者的LVEF 进行比较，同样无论住院还是院外随访期间，及早开通闭塞冠状动脉的A 组的LVEF 值高于B组。通过分析筛选出的A、B 组术后1 个月血液差异代谢物与心脏超声LVEF 进行相关分析发现，代谢物高，超声指标相应较差，高代谢物可能与心肌梗死后心功能较差有关，本研究也主要讨论代谢物与心肌梗死后心功能不全这一心血管不良事件的关系。

亮氨酸、缬氨酸属支链氨基酸（branched chain amino acids, BCAA），BCAA 是人体必需的氨基酸，除了合成蛋白质外，还是调节细胞代谢和生长的重要信号分子。王维等[13]通过复制小鼠心肌梗死模型发现，心肌梗死后会发生BCAA 代谢紊乱，导致BCAA 累积，饲喂BCAA 加重其累积后又发现，心肌梗死后的心功能紊乱和心肌重构进一步加重，这一结果证明BCAA 累积直接参与了心肌梗死后的心衰进程。心肌梗死行PCI 治疗后，组织细胞损伤加重，即缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI）[14-15]。研究证实，氧化应激是IRI 的主要发生机制[16]，活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）在其中扮演极其重要的角色。廉坤通过小鼠模型证实，高BCAA 血症加重小鼠心肌IRI，增加ROS 水平，即高BCAA 血症有心脏“毒性”作用，且该作用与氧化应激有关[13]。DU 等运用靶向质谱法测定PCI 术后发生心血管不良事件和未发生心血管不良事件的STEMI 患者入院时26 种氨基酸代谢产物的浓度，确定BCAA 在区分有心血管不良事件和无心血管不良事件的患者中具有极高的价值。并推测这一现象与先前研究确定的BCAA 分解代谢异常与心肌梗死和IRI 之间的相关性有关[17-18]。STEMI患者血管重建时间延长，心肌细胞受损程度要高于及时进行血运重建者，细胞缺血、缺氧更重，持续时间更长，加上心肌梗死发生时机体处于应激状态，引发心肌细胞更显著的自噬效应来降解蛋白质为氨基酸以维持心脏功能和活力[19-20]，因此本研究得出亮氨酸、缬氨酸含量在B 组含量相对较高。

肉碱是一种亲水性氨基酸衍生物，以游离肉碱和酰基肉碱两种形式存在，有L-肉碱（有生物活性）及D-肉碱两种异构体。有实验发现，冠状动脉闭塞后，脂肪酸将升高；脂肪酸的累积会损伤线粒体功能和呼吸链，不能进入线粒体进行能量代谢，进而导致酰基肉碱的累积。本研究发现C10、C12 等酰基肉碱在B 组含量较高，可能与B 组患者心肌缺血、缺氧时间更长有关。LIEPINSH 等[21]通过复制动物心肌IRI 模型发现，酰基肉碱积聚到足够浓度能抑制线粒体氧化磷酸化，刺激线粒体ROS的产生，损伤线粒体并增加心肌梗死面积，从而得出在线粒体中抑制酰基肉碱的产生有可能是一个有价值的心脏保护药物靶点的结论。还有研究证实，升高的长链酰基肉碱类物质会损害生物膜、钠泵及钙泵，导致膜的脂质双分子层流动性降低、细胞肿胀、钙超载等，甚至导致细胞死亡[22]。血液中肉碱积聚对心肌梗死后心功能产生不利影响，然而补充肉碱后可令心肌梗死后心肌获益。XUE等[23]通过复制小鼠IRI 模型发现，再灌注前腹腔注射左旋肉碱，可显著改善心脏功能;进一步研究表明这一机制可能与激活PI3K 通路有关，上调p-Akt 和Bcl-2（抗凋亡）蛋白的表达，下调Bax-2（抑制Bcl2，促进细胞凋亡）蛋白的表达，抑制IRI期细胞凋亡的发生。

综上所述，越早开通STEMI 患者闭塞冠状动脉，预后越好，较高的代谢物亮氨酸、缬氨酸及长链酰基肉碱等与心肌梗死后心功能不全有关。从代谢组学方面深化了对STEMI 患者及早进行血管重建的认识，并对心肌梗死后心功能不全的可能发生机制从代谢组学方面找到了新的研究方向。本研究由于样本量偏少，随访时间较短，且样本行代谢组学检测本身受多种因素影响，有其局限性，因此有待于深入研究。