刺山柑风湿止痛贴联合温和灸对佐剂型类风湿关节炎大鼠滑膜组织VEGF及slCAM-1表达的影响

昂沙尔·毕哈孜，霍新慧，丁 霞

（新疆医科大学中医学院针灸基础教研室，乌鲁木齐 830011）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）为常见的以滑膜炎、软骨及骨损害和关节周围脱钙为特点的疾病[1]，发病率和致残率较高[2]，以疼痛、皮下结节、关节畸形等为表现，可引起多系统组织损坏，甚至影响患者日常生活[3]。病理以滑膜细胞增生为主[4]。西药诊疗RA 不良反应多，易产生耐药性[5]；中草药具有很强抗炎、抗氧化活性,可减轻组织损伤[6];灸法、针刺等辅助疗法也在RA 治疗中有一定的作用[7]。本课题组前期研究明确，刺山柑和中医外治法温和灸对佐剂性RA 大鼠有镇痛抗炎作用[8]。本研究进一步观察刺山柑风湿止痛贴联合温和灸对滑膜组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和可溶性细胞间黏附分子-1（solub leinter cellular adhesion molecule slCAM-1）表达的影响，为其临床应用提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体(SPF) 级Wistar 大鼠60 只，雌雄参半，体重为160～200 g（动物供应中心-新疆医科大学）。在湿度55%～60%，20～24℃条件下饲养，明暗交替24 h，任意进食水。

1.2 药品与试剂弗氏完全佐剂（Sigma 公司），艾条（江苏康美制药有限公司），悬灸架（蕲春上工记艾灸器具有限公司），刺山柑果风湿止痛贴(20161022) 于新疆医科大学中医学院中药资源部供应。伤湿止痛膏(20170100）由黄石市力康药业公司购买。大鼠sl-CAM-1 及VEGF 的酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒、VEGF 抗体购自Elabsciece 公司，内参GAPPH(GR3249122-1)由英国Abcam公司购置。

1.3 设备购自成都泰盟有限公司(泰盟RB-200)的热板仪；瑞士Tecan 公司提供的全自动酶标仪；美国BIO-RAD Serial 提供的用型电泳仪、电泳槽和转印槽、经济型线性摇床及美国Proteinsimple(FE0723)提供的超灵敏全自动多色荧光成像分析系统。

1.4 实验方法

1.4.1 制备模型 60 只大鼠喂养3 d（称重、标号）后，用随机数字表法，取10只为空白组，其余大鼠进行佐剂型RA 大鼠造模，完全弗氏佐剂（0.1 mL 每只）足趾皮内注射，72 h后进行测评。依据类风湿关节炎指数（arthritis index，AI）评分评定[9]：0 分,无红肿;1 分,足趾轻微红肿;2 分,足跖与趾关节肿胀;3 分，足爪肿胀在踝关节之下;4 分,全部足爪肿胀5 分。每只大鼠的AI即四肢评分数相加，大于6分造模成功。

1.4.2 分组干预及穴位选取 随机分佐剂型RA 大鼠为模型组、对照组、刺山柑组、灸疗组、综合组，每组10 只。对照组予以伤湿止痛膏，刺山柑组予以刺山柑风湿止痛贴，模型组予以空白凝胶膏剂，均左后足趾经皮给药。灸疗组选取两侧肾俞、足三里穴予以温和灸，左右交替进行[8]。操作方法：以悬灸支架固定艾条，引燃艾条距离腧穴皮肤2 cm 处施灸，每2 min 轻弹艾灰，不吹火，灸至肌肤潮红，温热，可以忍受为度。两穴同时进行，每日1 次。以上治疗行3 个疗程，6 d 为1 个疗程，各疗程之间停休1 d。综合组予以刺山柑风湿止痛贴与温和灸综合治疗。

1.5 指标检测

1.5.1 一般状态 每天对大鼠的体质量、精神及活动情况、饮食摄水量、大小便等一般情况进行观察并做好相应记录。

1.5.2 足爪容积测定与AI指数 足爪容积测定：在注满水的玻璃刻度管中垂直插入大鼠足部至踝关节上方约l cm 后取出，加水至之前水面高度，标记剩下水量，两者之差为足爪容积。测2次取平均值为减少误差。AI指数评分方法同前。

1.5.3 血清VEGF、HIF-1a、slCAM-1 水平的检测 治疗后的大鼠予以腹主动脉采血，常温放1 h 将血清分离，-20℃保存。大鼠血清VEGF、HIF-1a、slCAM-1水平用ELISA试剂盒检测，具体按说明书规范操作。

1.5.4 滑膜组织VEGF蛋白表达测定 处死大鼠并用手术刀将左后足跖皮肤划开至大腿部，使踝关节周围的软组织完全剥离，将其放入4%多聚甲醛固定液中待用。病理切片滑膜组织，脱蜡至水；大鼠滑膜组织VEGF 的表达按照蛋白印迹(western blot)法检测，GAPDH 为内参。取大鼠滑膜组织用冰研磨，然后离心分离取上清，使用BCA 蛋白质试剂盒测定蛋白量；予加样、电泳、转膜、封闭，大鼠一抗VEGF(1∶500)4℃冰箱过夜，经过洗膜3 次后，ECL 显色，曝光及冲洗；采用Gel Doc XR 软件，算出VEGF 蛋白与GAPPH 吸光度比值。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。单因素方差分析用于各组间均数比较。组间均数采用多重比较，方差齐时使用LSD 法，方差不齐时使用Dunnett's T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠一般情况的影响造模后的佐剂型RA大鼠每日无精打采、食欲及体重下降，足部出现红肿，左后肢足跖部较严重，伴有部分四肢轻微红肿。治疗后大鼠精神和活动度等均有所改进，食量和体重均有增加。

2.2 对佐剂大鼠足爪容积和AI指数评分的影响与空白组相比，造模后大鼠足爪容积和AI 指数评分显著上调(P＜0.01),相比模型组，治疗组足爪容积和AI指数评分均降低，差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。

表1 每组大鼠AI指数评分和足爪容积比较（，n=10）

表1 每组大鼠AI指数评分和足爪容积比较（，n=10）

注：与空白组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.3 对大鼠血清VEGF 水平的影响与空白组相比，模型组大鼠血清VEGF 水平均上调(P＜0.01)，对照组也显著上调(P＜0.01)；与模型组比较，灸疗组和综合组显著下降(P＜0.05)，刺山柑组的各项指标均下降(P＜0.01)。与对照组比较，刺山柑组、灸疗组与综合组VEGF水平均下降(P＜0.05或P＜0.01)。见表2。

表2 各组血清VEGF比较（pg/mL，）

表2 各组血清VEGF比较（pg/mL，）

注：与空白组比较，＊P＜0.01；各治疗组与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.4 对大鼠血清HIF-1a 水平的影响与空白组比较，模型组大鼠血清HIF-1a水平均升高(P＜0.01)，对照组的HIF-1a 水平也明显升高(P＜0.01)。与模型组比较，灸疗组、刺山柑组、综合组的HIF-1a 水平均降低(P＜0.05 或P＜0.01)。与对照组比较，刺山柑组、灸疗组和综合组HIF-1a 水平均降低(P＜0.05或P＜0.01)。见表3。

表3 各组血清HIF-1a比较/(μg/L)

2.5 各组大鼠滑膜组织sICAM-1、VEGF 蛋白表达的比较与空白组比较，对照组和模型组slCAM-1的蛋白表达明显升高(P＜0.05，P＜0.01)。与模型组比较，治疗组的slCAM-1 表达均降低(P＜0.01)，与对照组比较，刺山柑组与综合组slCAM-1 蛋白表达显著降低(P＜0.01)。与空白组比较，模型组和对照组VEGF蛋白表达均升高（P＜0.05，P＜0.01），与模型组比较，治疗组VEGF 蛋白表达均降低（P＜0.01），灸疗组和综合组更为明显。见表4、图1。

表4 各组大鼠滑膜组织sICAM-1、VEGF蛋白表达的比较/(μg/L)

图1 每组大鼠滑膜组织VEGF蛋白表达比较

3 讨论

刺山柑为一种多年生灌木植物，根深大约30～100 cm，多刺，耐受恶劣环境[10]。刺山柑未熟的蓓蕾、果子和芽除被用于烹调以外，还发现具有广泛的医学用途，常用于治疗风湿、心血管和消化道等疾病[11]。刺山柑花、根可治疗肝肾疾病；刺山柑花可治疗瘫痪；刺山柑可治疗糖尿病；刺山柑的根和树皮可治疗脾肿大、精神障碍、营养不良等[12]。多种生物活性物质的存在使刺山柑具备多种药理活性，如消炎、降糖、降血脂等[13]。此外，刺山柑常作为治疗RA 药物，外敷法多用于治疗关节炎[14]。

RA 属中医“痹证”范围，本病多因平素营卫失调、气血亏虚并复感外邪,致使虚实夹杂,久病难愈[6]。艾灸可活血化瘀，是治疗RA 的传统中医方法之一[15]；它能有效调节RA模型动物血清TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6含量，从而减少炎性反应，减轻病变关节肿胀[16]。艾灸不仅起到消肿等作用，且经济简洁[17]，没有毒副作用，能够改善患者痛苦[18]。

肾俞穴可缓解骨骼疼痛，补肾益精，使肾阴肾阳充盈，骨髓得以滋养，利于关节经脉通利。足三里具有补中益气、调畅气机，舒经活络之效。故艾灸治则以足阳明经之合穴足三里保护脾胃为主，配以肾俞补肾益气为标，温经通络除湿，标本兼治[19]。温和灸肾俞、足三里能减少RA滑膜细胞的増殖与排出[20]。

VEGF 作为调节血管生成因子，在RA 血管翳形成中起重要作用，它能够促进血管通透性，使内皮细胞增殖和迁移，产生趋化性和毛细血管高通透性，因此参与炎症的发展[21]。它与VEGF 受体联合，可在炎症或氧分压低的情况下促使生长因子和细胞因子的分泌，病理性新生血管形成。新生血管就是滑膜血管翳的主要部门，关节液的营养因血管翳包裹着软骨而无法吸收，导致软骨破坏、血管翳对骨的侵蚀增加[22]。slCAM-1 作为一种可介导细胞黏附作用的糖蛋白，使滑膜内皮小静脉被血液中白细胞所黏附，引起周围炎症从而造成滑膜炎[23]。

综上，刺山柑风湿止痛贴和温和灸都能使RA 大鼠的炎症反应明显减轻，而刺山柑风湿止痛贴联合温和灸效果更为明显，其作用机制可能与下调VEGF水平，抑制slCAM-1蛋白而达到免疫调节功能有关。