MG53改善脂多糖诱导小鼠抑郁样行为的实验研究

龙香花，鲁 跃，裴昌贞

（重庆市大足区人民医院睡眠心身中心，重庆 402360）

抑郁症是一种高发病率、高复发率和高致残率的疾病，临床上常用五羟色胺再摄取抑制剂（Selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）和五羟色胺去甲肾上腺素再摄取抑制剂（Serotonin noradrenaline reuptake inhibitor，SNRI）等抗抑郁药进行治疗，但是仅50%的患者治疗有效，仅30%的患者获得痊愈[1]。因此亟需研发新型抗抑郁药物。研究证实，抑郁症的发生与免疫炎症损伤有关[2]，例如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是一种常用的促炎性内毒素，可以引起小胶质细胞和星形胶质细胞活化，使机体促炎细胞因子水平升高，诱发小鼠抑郁样行为[3]。Mitsugumin-53（MG53）是多功能三结构域(TRIM)蛋白家族中的成员之一，基本结构由N 末端的RING，B 盒和卷曲螺旋区域组成，其最早被发现与心肌细胞膜修复有关[4]，后来研究发现，MG53 能够参与胰岛素抵抗和炎症损伤等病理过程[5-6]。重组人MG53 可以改善机体损伤对心脏、骨骼肌、肺、肾、皮肤和大脑的影响[7]。Yao 等[8]发现，重组人MG53 可以透过血脑屏障，通过改善免疫紊乱对缺血性脑损伤起到保护作用。MG53是否能通过减轻免疫炎症损伤而改善抑郁症，既往鲜有报道。本研究建立LPS致小鼠抑郁模型，用糖水偏好实验和悬尾实验检测小鼠的抑郁情况[9-10]，检测海马小胶质细胞激活和炎症细胞因子表达水平，旨在探讨重组人MG53 改善LPS 诱导小鼠抑郁样行为的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂24 只成年雄性C57BL/6N 小鼠，体重20～25 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。重组人MG53 购于英国ABCAM 公司，LPS 购于上海复申生物科技有限公司，戊巴比妥购于天津一方科技有限公司，肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（Interleukin-1 β，IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购于武汉博士德生物科技有限公司，免疫荧光检测试剂盒购于上海瑞楚生物科技有限公司。转录因子κB（Transcription factor kappa B，NF-κB）p65、五羟色胺转运体（Serotonin transporter，5-HTT）、脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）和GAPDH内参抗体均购于美国Sigma公司。

1.2 动物干预将小鼠随机分为对照组、LPS组和LPS+MG53组，每组8 只。第1～4 天时对照组和LPS组腹腔注射等体积的生理盐水，LPS+MG53组腹腔注射重组人MG53（3 mg/kg[11]），1 次/d。LPS组和LPS+MG53组小鼠最后一次注射后的1 h，腹腔注射LPS（0.83 mg/kg[12]），对照组注射等体积的生理盐水。LPS注射24 h 后，对所有小鼠进行行为测试，随后处死小鼠，快速取出脑海马组织，储存于-80℃冰箱中。实验过程中对动物的处置符合2009 年《Ethical issues in animal experimentation》[10]相关动物伦理学标准的条例。

1.3 抑郁样行为测试

1.3.1 糖水偏好实验[9]先剥夺小鼠饮水6 h，后用蔗糖水和纯水双瓶给小鼠饮用，测量1 h 内小鼠的糖水或纯水消耗量，计算糖水偏好百分比（糖水消耗量/总液体消耗×100%）。

1.3.2 悬尾实验（Tail suspension test，TST）[10]小鼠放置于行为实验房间适应1 h，将小鼠尾部的后1/3固定于悬尾实验架上，头部朝下，头部距离箱底15 cm。用EthoVision XT7.0影像采集系统（荷兰Noldus）进行摄像，计时5 min，前2 min为小鼠不动潜伏期时间，后3 min为小鼠不动总时间。

1.4 免疫荧光法检测海马小胶质细胞激活情况用 150 mg/kg 戊巴比妥麻醉小鼠，以37℃生理盐水经右心耳迅速灌注，随后用4℃4%多聚甲醛溶液灌注。灌注完毕后立即取脑固定、脱水和切片，切片厚度为25 μm。将切片放置于切片保护液中，保存于-20℃冰箱。0.1 M PBS 漂洗切片后用10%山羊血清封闭，1 h后加入IBA1一抗（1∶500），4℃过夜，0.1 M PBS冲洗后加入Alexa Fluor 488标记的羊抗鼠二抗（1∶1 000），避光1 h，0.1 M PBS 冲洗后封片，在尼康ECLPSE 80i 荧光显微镜下观察海马免疫染色切片。每只小鼠标本随机选取3 张切片，每张切片选取3 个视野，用Image-Pro-plus 6.0软件对IBA1阳性细胞的密度进行自动分析，在×20 倍放大镜下分析小胶质细胞胞体面积和突起长度，取平均值。

1.5 ELISA 法检测炎症细胞因子表达水平取小鼠海马组织，每100 mg组织中加入1 mL PBS缓冲液，超声匀浆10 min 后在4℃孵化1 h，得到的组织匀浆在120 000 g下离心，获取上清液。用ELISA试剂盒检测上清液中TNF-α、IL-1β 和IL-6 浓度，实验步骤严格按照试剂盒说明书操作。

1.6 Western-blot 检测蛋白表达水平用RIPA 裂解液提取海马组织中总蛋白，用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，10%SDS-PAGE 分离蛋白，用半干法将蛋白转至PVDF 膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，加入NF-κB p65 一抗（1∶500）、5-HTT 一抗（1∶500）或BDNF 一抗（1∶500），4℃过夜孵育，次日除去一抗，用TBST 缓冲液洗涤3 次后加入羊抗兔二抗（1∶500），封闭1 h。以GAPDH作为内参，用ECL发光仪对蛋白成像，用Image J软件分析灰度值。

1.7 统计学方法采用SPSS22.0 软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠抑郁样行为比较对照组糖水偏好百分比为（81.04±15.12）%，TST 不动时间为（52.01±9.89）s；LPS组分别为（57.90±10.01）%、（76.68±9.13）s；LPS+MG53组分别为（75.23±11.28）%、（53.09±7.12）s。与对照组比较，LPS组糖水偏好百分比降低，TST不动时间延长（P＜0.05）。与LPS组比较，LPS+MG53组糖水偏好百分比增高，TST 不动时间缩短（P＜0.05），见图1。

图1 各组小鼠抑郁样行为比较（n=8）

2.2 各组小鼠海马小胶质细胞激活情况比较对照组IBA1 阳性细胞数为（69.23±10.12）个/mm2，小胶质细胞胞体面积为（37.80±8.79）μm2，小胶质细胞突起长度为（21.89±7.34）μm；LPS组分别为（121.29±13.10）个/mm2、（119.45±33.07）μm2、（11.70±3.20）μm；LPS+MG53组分别为（88.10±15.14）个/mm2、（78.98±18.45）μm2，（18.00±4.62）μm。与对照组比较，LPS组IBA1阳性细胞数增多，小胶质细胞胞体面积变大，而小胶质细胞突起长度变短（P＜0.05）。与LPS组比较，LPS+MG53组IBA1 阳性细胞数减少，小胶质细胞胞体面积缩小，而小胶质细胞突起长度变长（P＜0.05），见图2。

图2 免疫荧光法检测小鼠海马小胶质细胞的激活情况

2.3 各组小鼠海马组织炎症细胞因子表达水平比较

对照组海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白浓度、NF-κB p65蛋白相对表达水平分别为（23.45±8.34）pg/mL、（88.11±28.79）ng/L、（65.02±25.00）ng/L、（0.43±0.09），LPS组分别为（57.90±10.01）pg/mL、（142.12±43.09）ng/L、（156.02±65.02）ng/L、（1.21±0.12），LPS+MG53组分别为（35.90±7.76）pg/mL、（110.23±36.78）ng/L、（100.03±19.89）ng/L、（0.65±0.09）。与对照组比较，LPS组海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白浓度及NF-κB p65蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）。与LPS组比较，LPS+MG53组TNF-α、IL-1β 和IL-6 蛋白浓度及NF-κB p65蛋白相对表达水平降低（P＜0.05），见图3。

图3 各组小鼠海马组织炎症细胞因子表达水平比较

2.4 各组海马组织5-HTT 和BDNF 表达水平比较对照组海马组织5-HTT 和BDNF 蛋白相对表达量分别为（1.34±0.08）、（1.14±0.09），LPS组分别为（0.41±0.04）、（0.52±0.10），LPS+MG53组分别为（0.87±0.09）、（0.72±0.10）。与对照组比较，LPS组海马组织5-HTT 和BDNF 表达水平降低（P＜0.05）；与LPS组比较，LPS+MG53组5-HTT和BDNF表达水平升高（P＜0.05），见图4。

图4 各组海马组织5-HTT和BDNF表达水平比较

3 讨论

抑郁症的发病机制有单胺神经递质假说、谷氨酸假说、下丘脑-垂体-肾上腺轴假说、神经营养假说和炎症假说等。临床上常用的SSRI 和SNRI 等抗抑郁药的治疗有效率不足50%[1]。本研究结果显示，重组人MG53 对LPS 诱导的小鼠抑郁样行为有一定改善作用。

细胞膜完整性在维持细胞内稳态方面起着重要作用，细胞膜缺陷会导致细胞死亡，并且与多种疾病有关，例如神经退行性疾病[13]。既往研究发现，MG53对细胞膜损伤和组织损伤有一定保护作用[14]。MG53与磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）结合，并与caveolin-3 蛋白相互作用，进而修复损伤的细胞膜[15]。在组织修复中，MG53与磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的亚单位P85 及caveolin-3 相互作用，随后激活Pl3K/Akt/GSK3β 信号通路和ERKl/2 信号通路，进而保护缺血性脑损伤和心肌损伤[8,16]。

免疫炎症损伤是抑郁症发病的重要机制之一，抑郁症患者外周血炎症细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平升高[17]。转录因子NF-κB 调控炎症细胞因子表达及免疫应答，在抑郁症中表达水平也较高[18]。LPS 腹腔注射是抑郁症经典模型。本研究中，一次性腹腔注射0.83 mg/kg LPS 诱导了小鼠抑郁样行为，糖水偏好百分比明显降低，TST 不动时间延长，与既往报道一致[9,19-20]。

既往研究发现，MG53 能够改善炎症损伤和氧化应激损伤[21]。免疫荧光染色实验中，IBA1 阳性细胞数、小胶质细胞胞体面积、突起长度用于评估小胶质细胞的激活[22]。本研究发现，重组人MG53 可以降低LPS诱导的海马小胶质细胞激活（IBA1阳性细胞数增多，小胶质细胞胞体面积变大，小胶质细胞突起长度变短），并降低NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平。Ma 等[23]的研究也发现，MG53 可以改善人脐带间充质干细胞和小鼠大脑的胶质细胞活化，降低TNF-α、TOLL 样受体4、炎症小体NLRP3 和IL-1β 表达水平。海马炎症损伤使5-HTT 和BDNF 表达水平下降，进而诱发抑郁[24]。本研究也发现，重组人MG53使海马组织5-HTT和BDNF表达水平升高，进一步验证了重组人MG53的抗抑郁效果。

综上所述，重组人MG53 可通过改善海马炎症损伤而改善LPS 诱导的小鼠抑郁样行为，MG53 可能成为抑郁症的治疗靶点。未来需要进一步深入研究，明确MG53在抑郁症中的分子生物学机制。