LINC00473在肝细胞癌中的表达及其功能研究

王 慧，张凯楠，赵 辉

（1新疆医科大学第一附属医院医学检验中心，乌鲁木齐 830054；2新疆医科大学研究生学院，乌鲁木齐 830011）

肝细胞肝癌（HCC）是目前全球原发性肝癌中死亡率较高的恶性疾病。它是全球范围最常见的恶性肿瘤之一[1]，其发病率和病死率呈现逐年递增[2]。研究报告显示，其五年生存率低于10%[3]。HCC 死亡率、复发率和转移率高[4]，但其复发转移的具体分子机制尚未被完全阐明[5-6]。长链非编码RNA（lncRNA）作为一类新的转录物，也是重要的基因表达调节剂[7]。它在肝癌、胃癌、肺癌等癌症中生物学功能的研究呈指数增长[8-9]。已有多项研究表明，长链非编码RNA LINC00473 在胃癌[10]、肺癌[11]、乳腺癌[12]、结直肠癌[13]等癌症中均存在不同程度的表达差异。本研究旨在通过检测LINC00473 在肝癌组织和细胞中的表达情况，分析LINC00473 表达水平与HCC 患者临床特征及预后的相关性，为肝癌复发转移的机制提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 组织标本选取新疆医科大学第一附属医院研究基地已建立的疾病资源标本库组织样本（癌组织和距离癌组织大于5 cm 的癌旁组织）20 例。组织样本均有明确的病理诊断，且通过新疆医科大学第一附属医院医学伦理和人类临床试验委员会审查（伦审号：K201906-06）。纳入标准：符合中国卫生和计划生育委员会颁布的原发性肝癌诊疗规范2017版制定的原发性肝癌的诊断标准中原发性肝癌中的结节型肝细胞癌和巨块型肝细胞癌。排除标准：患有继发性肝癌、原发性肝癌中的肝内胆管癌、混合性肝癌以及肝细胞肝癌中的弥漫型肝癌或合并其他癌症患者。

1.2 正常肝细胞系和肝癌细胞系HepG2、Huh-7、SMMC-7721、L02、HCC-LM3 和HCC-LM9、SMMC-7402均购自中科院上海细胞生物研究所。

1.3 标本及临床病理参数收集

1.3.1 标本保存 将肝脏组织癌变标本分成若干均匀大小、50～100 mg 左右的组织，置于冻存管内，并保证组织标本在冻存管内不重叠，加入RNA保存液，4℃冰箱过夜后置于-80℃冰箱或液氮保存。所有肝细胞系均于37℃，5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养。

1.3.2 临床病理参数收集 患者相关的临床背景及病理诊断资料通过住院病历进行收集，所有检查结果均以第一次手术入院结果为准，主要包括年龄、性别、肿瘤淋巴结转移（TNM）分期、美国癌症联合委员会（AJCC）临床分期、肿瘤大小、肝炎病史、甲胎蛋白(AFP)、病理分级等。

1.4 癌症基因组图谱（TCGA）数据库筛选差异lncRNA通过TCGA 数据库筛选出371 例病例的基因表达水平数据用于综合分析。利用cbioportal 收集本研究纳入对象的RNA 测序数据，使用R 软件中的“edgeR”软件包[14]识别差异表达的RNA（DERNA）。

1.5 实时荧光定量核酸扩增检测采用Trizol 法提取组织及细胞总RNA。根据HiScript Reverse Transcriptase(vazyme,China)说明书合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），最后通过qRT-PCR 检测组织和细胞中LINC00473 的表达水平，反应系统使用的cDNA 进行7倍稀释。实验分为对照组及内参（GAPDH）、阴性对照组（包括试剂空白对照组及灭菌双蒸水对照组），每个标本重复3次实验，引物序列见表1。

表1 引物序列信息

1.6 细胞培养将正常肝细胞L02 和肝癌细胞HepG2、Huh-7、SMMC-7721、Bel-7402、HCC-LM3、HCC-LM9 细胞置于含10%胎牛血清的完全培养基中，培养瓶培养条件为37℃，含有5% CO2的二氧化碳培养箱中，湿度为95%。

1.7 细胞转染将培养基中传代培养的正处于对数生长期的HepG2 细胞，以3×105个/孔，置于6 孔板，37℃及5%CO2培养箱中培养；针对LINC00473(NR_026860.1)设计3条小干扰RNA（siRNA）和3条反义寡核苷酸（ASO）混合物构成智能沉默（smart silencer），分组对细胞进行处理。阴性转染组：HepG2+smart silencer-NC；LINC00473干扰组：HepG2+smart silencer-LINC00473。转染步骤按Lipofectamine 2000（Invitrogen，2000）说明书进行。

1.8 5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（EDU）细胞增殖将转染好的两组细胞置于6孔板中进行培养，将37°C 预热的2 倍EdU 工作液(20 μmol/L)等体积加入6孔板中，使6 孔板中的EdU 终浓度变为10 μmol/L，收集细胞，置于流式细胞仪上检测，激发波长488 nm，发射波长520 nm。

1.9 Transwell小室检测细胞迁移与侵袭

1.9.1 细胞迁移 细胞转染48 h 后，消化收集重悬细胞，将小室加入至24 孔板中，分别在transwell 小室上室加入200 μL细胞悬液，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养48 h；细胞染色后静置20 min后显微镜下观察并拍照记录。

1.9.2 细胞侵袭 将细胞稀释至3×105cell/mL 备用；在24 孔板中加入4℃预冷800 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培养基（含双抗），并放入transwell 小室，在transwell 小室上室底部中央垂直加入100 μL 终浓度为1 mg/mL的基质胶（matrigel），在37℃条件进行温育4～5 h，待matrigel 成胶状后，在transwell 上室分别加入200 μL 各组细胞悬液，37℃，5%CO2条件培养箱下培养24 h；细胞染色后静置20 min后在显微镜下观察并拍照记录。

1.10 流式检测细胞凋亡按照说明书处理细胞后使用Annexin V-APC apoptosis analysis kit 进行检测。在实验组检测同时，设置阴性对照组[不加膜联蛋白（Annexin）和7-氨基放线菌素D（7-AAD）的正常细胞]；阳性对照组的选取条件为凋亡效果最显著的溶剂组，并分为两组。其中，阳性对照组1 加入5 μL 的AnnexinV 单标；阳性对照组2 只加5 μL 的7-AAD 单标。最后流式细胞仪上机检测。

1.11 统计学处理所有数据采用SPSS 21.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，Grapahpad prism 8 软件绘制生存曲线并且利用logrank检验进行差异分析。对LINC00473 在癌与癌旁组织中的表达，采用配对t检验；对不同病理学特征亚组的HCC 患者LINC00473 的表达丰度进行分析采用成组t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00473 在HCC 中的表达在TCGA 数据库中筛选得到，LINC00473在肝细胞肝癌组织中比癌旁组织表达上调，见表2。LINC00473 在癌组织中的表达比癌旁组织显著上调（P＜0.05），见图1A。肝癌细胞系中LINC00473 的表达水平显著高于正常肝细胞系，见图1B。其中LINC00473 在HepG2 细胞系中表达水平最高，在Huh-7细胞中表达水平最低。

图1 LINC00473在肝癌组织和细胞系中表达情况

表2 TCGA数据库中LINC00473在HCC癌和癌旁组织中的表达水平（）

表2 TCGA数据库中LINC00473在HCC癌和癌旁组织中的表达水平（）

2.2 LINC00473 表达与临床病理参数的相关性肝癌组织中LINC00473 的表达与患者年龄、TNM 分期、AJCC 临床分期、甲胎蛋白（AFP）相关（P＜0.05），见表3。在TCGA 数据库与本地样本组织中，LINC00473的表达水平与肝癌患者的生存时间无明显相关性（P＞0.05），见图2。

图2 LINC00473的表达与肝癌患者预后相关性

表3 LINC00473与HCC患者临床病理参数相关性分析

2.3 抑制LINC00473 调控肝癌细胞的增殖、侵袭及凋亡结果EDU 细胞增殖结果显示，抑制LINC00473可抑制HepG2 细胞增殖，见图3A。Transwell 迁移侵袭分析结果表明，沉默LINC00473对细胞迁移无明显影响，但沉默LINC00473组的侵袭细胞少于对照组，见图3B、3C。此外，流式细胞检测术细胞凋亡的结果显示，沉默LINC00473 促进细胞早晚期凋亡，见图3D。

图3 抑制LINC00473可抑制肝癌细胞的增殖、侵袭，细胞凋亡

3 讨论

既往研究证实多种lncRNAs 在肝癌发病过程中发挥重要作用[15]。如，HOTAIR 在肝癌中起着促癌作用，它能促进细胞增殖和侵袭,抑制了肝癌细胞的凋亡[16]。Chen 等[17]发现lncRNA CDKN2BAS在转移性HCC组织中显著上调，在体内、外均可促进HCC 细胞生长和迁移。本研究发现，LINC00473在肝癌组织和细胞中表达上调。此外，LINC00473表达水平与肝癌患者临床病理特征相关。通过进一步研究LINC00473 在肝癌中的作用，发现抑制LINC00473 可以抑制肝癌细胞的增殖和侵袭，促进肝癌的细胞凋亡，证明LINC00473在肝癌中起着癌基因的作用。

LINC00473，也称为C6orf176，编码来自6q27 染色体基因座的基因间lncRNA[18]。本研究结果表明，LINC00473表达水平的增高可能参与了肝癌的进展。LINC00473在其他癌症中也有类似的发现。如，神经胶质瘤中LINC00473表达水平显著升高，抑制了胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并可以预测胶质瘤患者预后不良[19]。不仅如此，LINC00473 在体外可促进宫颈癌细胞的细胞增殖并抑制细胞凋亡[20]。而Zhu等[21]发现LINC00473 在肾母细胞瘤肿瘤组织中的表达高于正常组织，敲除LINC00473有效抑制了肾母细胞瘤的生长。

TCGA 数据库筛选结果显示，LINC00473 在HCC癌组织中表达水平显著高于癌旁组织，在肝癌患者组织中存在差异表达，进一步与本地肝细胞肝癌患者样本组织进行验证。在本地样本20例HCC患者组织标本中与癌旁组织相比，LINC00473的表达在癌组织中明显上调；患者相关临床病理特征结果发现，LINC00473 同HCC 患者年龄、TNM 分期、AJCC 临床分期、AFP显著相关，与患者肿瘤大小、肝炎病史等指标无明显相关性，高表达LINC00473的患者有更差的临床病理特征。这说明，LINC00473可能参与肿瘤的局部浸润和转移，起着促进肿瘤的作用。ZHOU 等[22]的研究也表明，LINC00473与胃癌病例中的恶性状态和预后相关，并且作为致癌细胞迁移和侵袭的致癌lncRNA起作用。

细胞功能实验验证了沉默的LINC00473 可抑制HCC 细胞增殖、侵袭，促进细胞凋亡。XIN 等[23]也发现LINC00473 在前列腺癌中通过调节miR-195-5p/SEPT2 轴，通过JAK-STAT3 信号通路促进细胞增殖。这提示，LINC00473 的上调可能通过促进细胞增殖，使肿瘤细胞加速生长，起着促进肿瘤发生的作用。因此，有必要进一步通过生物信息学研究探索LINC00473在HCC发生发展中的分子机制，这对揭示HCC的发生发展具有积极意义，也能为肝癌的诊断与治疗提供新的思路。