基于网络药理学和质量源于设计理念的栀子豉汤提取工艺研究

胡钟姣，郑露露，许光亚，郭晓恒，时 政*

基于网络药理学和质量源于设计理念的栀子豉汤提取工艺研究

胡钟姣1, 2，郑露露3，许光亚4，郭晓恒4，时 政1, 2*

1. 成都大学附属医院/临床医学院，四川 成都 610081 2. 遵义医科大学药学院，贵州 遵义 563000 3. 成都大学食品与生物工程学院，四川 成都 610106 4. 成都大学基础医学院，四川 成都 610106

采用网络药理学方法探讨栀子豉汤治疗失眠的作用机制；基于质量源于设计（quality by design，QbD）理念，构建并验证栀子豉汤提取工艺的设计空间。通过TCMSP、PharmMapper、Drugbank、GeneCards、Therapeutic Target Database、OMIM等数据库获取栀子豉汤的成分和对应靶点；利用STRING、DAVID数据库和分子对接技术对栀子豉汤治疗失眠的潜在靶点进行分析。以栀子豉汤提取物中的栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、大豆苷元、染料木素的提取率及干膏得率作为关键质量属性（critical quality attributes，CQAs），Plackett-Burman设计筛选关键工艺参数（critical process parameters，CPPs），Box-Behnken实验对CPPs进行优化，并构建栀子豉汤提取工艺的设计空间。栀子豉汤的主要活性成分栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、大豆苷元、染料木素等，通过作用于白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin- 6，IL-6）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）等核心靶点，参与调节神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、γ-氨基丁酸能突触（GABAergic synapse）、TNF因子信号通路（TNF signaling pathway）等信号通路发挥治疗失眠的作用。栀子豉汤提取工艺的设计空间范围为溶剂用量8～11倍、提取时间为30～84 min，提取次数为1～2次。栀子豉汤可能通过多成分-多靶点-多通路治疗失眠。基于QbD理念建立的栀子豉汤提取工艺设计空间，稳健可靠，可为其制剂的工艺开发提供参考。

栀子豉汤；网络药理学；失眠；分子对接；质量源于设计；设计空间；提取工艺；栀子苷；京尼平龙胆双糖苷；大豆苷元；染料木素；白细胞介素-1β；白细胞介素-6；雌激素受体1；一氧化氮合酶3

栀子豉汤始载于东汉末年医圣张仲景的《伤寒论》太阳、阳明篇，由栀子和淡豆豉2味中药组成[1]。栀子，味苦性寒，入心、肺、三焦经，具有泻火除烦的功效，尤其善泻心火而除烦[2]。《本草正》载：“栀子，若用佐使，治有不同：加茵陈除湿热黄疸，加豆豉除心火烦躁”。淡豆豉，味辛甘微苦性寒，归肺、胃经，具有解表除烦、宣发郁热的功效。其气味轻薄，既能解表宣热，载栀子上行，又能降胃和中，两药合用，共奏清宣胸中郁热，古代用于治疗虚烦不得眠，心中懊恼之症[3]。现代临床主要用本方或加味治疗失眠、抑郁、更年期综合征、心血管疾病、胃脘疼痛等[4-5]，疗效显著。中药具有多成分、多途径和多靶点协同作用等特点，在预防和治疗疾病方面有其独特的优势，但同时也对深入研究其治疗疾病的作用机制带来困难[6]。网络药理学是一门新兴的学科，是在系统生物学与计算机技术高速发展的背景下发展起来的，其通过揭示中药化合物的作用和治疗机制来研究药物、靶点和疾病之间的关系，阐明中药对疾病的作用机制[7-9]。网络药理学的系统性质与中医的整体观点相一致，可以为研究中药药效物质基础及作用机制提供新的、有益的技术支持，在一定程度上反映了中药研究的新趋势[10-12]。

质量源于设计（quality by design，QbD）是一种系统性研究方法，是通过实验设计（design of experiment，DoE）来评价关键质量属性（critical quality attributes，CQAs）和关键工艺参数（critical process parameters，CPPs）间的关系模型[13-14]。在多响应变量下，通过构建设计空间来确定最佳工艺参数范围，从而建立稳定可靠的生产工艺，最终保障产品质量[15]。本研究通过网络药理学方法预测栀子豉汤治疗失眠的活性成分、潜在作用靶点和作用机制，同时利用分子对接技术来进一步预测重要活性成分和潜在靶点的结合能力。此外，以QbD理念为指导，利用Plackett-Burman实验设计，从多个影响因素中筛选影响栀子豉汤有效成分提取的CPPs，随后用Box-Behnken实验设计对筛选出的CPPs进行优化，建立栀子豉汤提取工艺的设计空间。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Essentia LC-16高效液相色谱仪，岛津仪器（苏州）有限公司；CP224C电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；十万分之一天平，天津市德安特传感技术有限公司；SB-5200DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；JL-UPT-I I-10T实验室超纯水系统，四川金澜科技有限公司。

1.2 试药与试剂

对照品栀子苷（批号MUST-20102310，质量分数≥98%）、大豆苷元（批号MUST-20101107，质量分数≥98%）购自成都曼思特生物科技有限公司；京尼平龙胆双糖苷（批号P27S10F96112，质量分 数≥98%）、染料木素（批号Y19D7C27145，质量分数≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈，色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司；冰醋酸（色谱纯）、甲醇（分析纯），成都市科隆化学品有限公司；水为超纯水。

栀子（批号20110206，产地江西）、淡豆豉（批号20110104，产地四川）均购自四川国强中药饮片有限公司，经成都大学郭晓恒教授鉴定，分别为茜草科栀子属植物栀子Ellis的干燥成熟果实、豆科豆属植物大豆(L.) Merr.的干燥成熟种子（黑豆）的发酵加工品。

2 方法与结果

2.1 栀子豉汤网络药理学研究

2.1.1 栀子豉汤成分收集 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php）和查阅相关文献报道[16-17]对栀子豉汤中的成分进行整理、分析，得到栀子豉汤成分14个，结果如表1所示。

表1 栀子豉汤的成分信息

Table 1 Chemical composition information of ZD

来源成分PubChem CID分子式 栀子西红花酸5281232C20H24O4 绿原酸1794427C16H18O9 京尼平442424C11H14O5 京尼平苷酸443354C16H22O10 西红花苷I5281233C44H64O24 栀子苷107848C17H24O10 熊果酸64945C30H48O3 京尼平龙胆双糖苷3082301C23H34O15 淡豆豉黄豆黄素5317750C16H12O5 大豆苷元5281708C15H10O4 染料木苷5281377C21H20O10 大豆苷107971C21H20O9 染料木素5280961C15H10O5 黄豆黄苷187808C22H22O10

2.1.2 靶点的预测与筛选 利用TCMSP平台、PharmMapper数据库（http://www.lilab-ecust.cn/ pharmmapper/）对成分靶点进行预测，使用UniProt网站（https://www.uniprot.org/）对靶点蛋白进行基因名转换、校正。以失眠（insomnia、sleeplessness、wakefulness、agrypnia）为检索词，分别在数据库Drugbank（https://www.drugbank.com/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、Therapeutic Target Database（http://db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https:// omim.org/）中进行检索，合并并去除重复靶点，得到582个失眠相关靶点。利用微生信在线网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制成分靶点与失眠相关靶点韦恩图，如图1所示，得到51个栀子豉汤治疗失眠的潜在作用靶点。

2.1.3 PPI网络的构建 将得到的潜在靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/），选择物种为Homo sapiens，得到靶点的PPI网络信息，导入Cytoscape 3.7.1软件构建网络并进行拓扑分析。如图2所示，该网络涉及48个节点和223条边，度值（degree）的中位数为5，介度中心度（betweenness centrality）的中位数为16.845 9，紧密中心度（closeness centrality）的中位数为22.725。在此PPI网络中度值较高的靶点有白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6，度值24）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF，度值21）、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3，度值18）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β，度值18）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1，度值17）。度值越高，表明与其他靶点的相互作用越强，对疾病的影响也就越大。故可推测栀子豉汤中的活性成分可能作用于上述靶点而发挥治疗失眠的作用。

图1 栀子豉汤靶成分靶点与失眠相关靶点韦恩图

图2 靶点蛋白相互作用网络图

2.1.4 基因本体（gene ontology，GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 将靶点导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行GO和KEGG富集分析，以＜0.05为筛选条件，得到相关分析结果。利用Bioinformatics（http:// www.bioinformatics.com.cn/）和Sangerbox（http:// sangerbox.com/index）在线网站分别对GO和KEGG结果进行可视化。GO分析表明，栀子豉汤可能通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联的正向调节（positive regulation of MAPK cascade）、γ-氨基丁酸信号通路（γ- aminobutyric acid signaling pathway）、信号转导（signal transduction）等生物过程发挥治疗作用，结果见图3。

图3 潜在靶点的GO富集分析

KEGG富集通路分析表明，栀子豉汤中的活性成分可能通过神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、γ-氨基丁酸能突触（GABAergic synapse）、TNF因子信号通路（TNF signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）等通路发挥治疗失眠的作用，见图4。

2.1.5 分子对接验证 靶点蛋白结构通过PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取，化合物3D结构通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）获取。利用Pymol软件删除蛋白质分子中的无关小分子，并导入AutoDock Tools软件进行删除水分子、加氢及设置原子类型操作。用ChemBio3D软件对化合物进行能量最小化，用AutoDock Tools软件删除水分子并添加原子电荷、分配原子类型。将处理后的化合物作为小分子配体，蛋白靶点作为受体，通过AutoDock vina软件进行对接。如表2所示，栀子豉汤中的活性成分除熊果酸与ESR1外，其余成分与核心靶点的结合能均小于−5 kJ/mol，表明配体与受体可以自发结合。其中黄豆黄苷、大豆苷、西红花酸、染料木苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、京尼平苷酸与所选核心靶点的结合性均优于阳性对照药。栀子豉汤的主要活性成分与核心靶点的对接情况表明，栀子豉汤可能通过调节以上靶点发挥治疗作用。

2.2 栀子豉汤活性成分含量测定方法的建立

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品栀子苷12.33 mg、京尼平龙胆双糖苷10.03 mg、大豆苷元10.18 mg、染料木素11.51 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分别精密移取上述对照品溶液适量，加甲醇稀释成系列质量浓度的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密吸取栀子豉汤水提液1 mL，加甲醇定容至5 mL，摇匀，即得。

图4 潜在靶点的KEGG通路富集分析

表2 活性成分与核心靶点的分子对接

Table 2 Molecular docking of the compound with target

成分结合能/(kJ∙mol−1) IL-1βESR1IL-6NOS3TNF 京尼平苷酸−26.74−38.49−26.65−36.02−31.05 绿原酸−26.40−40.84−27.20−33.68−29.96 西红花酸−30.75−44.10−26.53−37.28−31.71 大豆苷元−23.64−30.96−24.06−32.38−25.10 大豆苷−30.92−41.05−31.38−38.49−31.84 京尼平龙胆双糖苷−28.28−39.71−30.12−42.84−36.61 京尼平−22.84−32.05−24.89−27.99−26.74 染料木素−24.39−31.59−27.20−33.39−25.82 染料木苷−28.45−42.26−25.65−37.40−32.26 大豆黄素−25.86−34.98−25.56−34.94−25.61 黄豆黄苷−31.80−41.17−29.62−38.45−31.59 熊果酸−25.65−−25.52−35.44−31.05 栀子苷−27.57−39.12−26.90−38.49−31.71 地西泮−23.77−36.32−24.18−34.64−29.04

2.2.3 色谱条件

（1）栀子苷、京尼平龙胆双糖苷：色谱柱为Ecosil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（10∶90）；检测波长239 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL；体积流量1 mL/min。

（2）大豆苷元、染料木素：色谱柱为Ecosil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈- 1%冰醋酸水溶液（25∶75）；检测波长260 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL；体积流量1 mL/min。

2.2.4 专属性实验 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液和“2.2.2”项下供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件测定。结果表明，供试品溶液中各组分的色谱峰分离良好，且在对照品溶液相同的保留时间处有相同的色谱峰，见图5。

2.2.5 线性关系考察 分别精密吸取不同质量浓度的系列对照品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件测定峰面积。以对照品质量浓度为横坐标（），峰面积为纵坐标（），绘制标准曲线，得到栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、大豆苷元、染料木素的回归方程分别为＝15 871－6 007.6（＝0.999 7）、＝12 420＋32 753（＝0.999 6）、＝65 359－1 396.1（＝0.999 8）、＝89 274－2 331.7（＝0.999 6）。结果表明，栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、大豆苷元、染料木素分别在49.32～616.50、6.018～50.150、0.814 4～2.850 4、0.460 4～1.611 4 μg/mL线性关系良好。

2.2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，连续进样6次，结果栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、大豆苷元、染料木素峰面积的RSD分别0.39%、0.35%、0.58%、1.55%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 精密称取样品6份，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，结果栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、大豆苷元、染料木素提取率的RSD分别为3.18%、3.53%、1.07%、1.81%，表明该方法重复性良好。

图5 混合对照品(A)和栀子豉汤样品(B)的HPLC图

2.2.8 稳定性试验 精密称取样品，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，分别在0、2、4、8、12、24 h按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，结果栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、大豆苷元、染料木素峰面积的RSD分别为0.14%、1.96%、0.98%、0.99%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.9 样品测定及提取率计算 将“2.2.2”项下制备供试品溶液，按照“2.2.3”项下色谱条件进样测定，并参照文献方法计算提取率[18]。

提取率＝各指标成分质量/总投药量

2.3 干膏得率的测定

按干燥失重法进行测定，精密量取栀子豉汤提取液25 mL于干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃电热鼓风干燥箱中干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速称定质量，再于105 ℃干燥1 h，冷却称定质量，反复干燥至恒定质量（即±0.3 mg），即得水溶性浸出物的干燥品，计算干膏得率。

干膏得率＝(25)

为25 mL提取液中干浸膏质量，为提取液总体积，为药材质量

2.4 栀子豉汤提取工艺优化

2.4.1 CQAs和CPPs的确定 结合前期网络药理学相关结果、文献研究热度、具有一定药理作用以及《中国药典》2020年版对各味中药指标性成分的规定，将栀子苷（1）、京尼平龙胆双糖苷（2）、大豆苷元（3）、染料木素（4）提取率和干膏得率（5）作为栀子豉汤的CQAs。

Plackett-Burman设计法是一种经济而有效的2水平实验方法，可以通过较少的实验快速从众多实验中筛选出显著的影响因素，为后续的工艺优化提供支持。以浸泡时间（1）、溶剂用量（2）、提取时间（3）、提取次数（4）作为筛选因素。根据前期预实验结果，利用Minitab 18软件进行Plackett- Burman实验设计，实验设计安排及结果见表3。

分别以1～5对1～5进行线性回归，得到回归方程：1＝37.110－0.1831＋1.8852＋3.0943＋8.0134，2＝3.110 6－0.044 61＋0.120 12＋0.681 73＋1.396 74，3＝0.318 31－0.004 141＋0.022 262＋0.035 013＋0.110 224，4＝ 0.168 33－0.005 001＋0.013 332＋0.021 673＋0.065 004，5＝5.47＋0.005 081＋0.2542＋0.058 803＋4.9504。

对Plackett-Burman实验结果进行方差分析，结果见表4。由表可知，浸泡时间1的值均大于0.05，表明其对1、2、3、4、5的影响不显著，而溶剂用量2或提取时间3、提取次数4对1、2、3、4、5有显著影响。结合标准化效应的pareto图，见图6，最终确定溶剂用量2、提取时间3、提取次数4为CPPs。

2.4.2 Box-Behnken优化提取工艺 根据Plackett- Burman实验结果，以溶剂用量（2）、提取时间（3）、提取次数（4）为自变量，以栀子苷（1）、京尼平龙胆双糖苷（2）、大豆苷元（3）、染料木素（4）、干膏得率（5）为响应值，对栀子豉汤提取工艺进行优化。利用软件Design-Expert 12，设计3因素3水平实验，实验设计安排与结果见表5。

2.4.3 设计空间的建立及验证 采用Matlab（2018b）软件提供的Monte Carlo方法，其中计算步长为0.02，达标概率为0.9，模拟次数为1万次[19]，计算得到栀子豉汤的设计空间，见图7，随机选取4个点进行验证，每个实验点平行2次，以提取液中栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、大豆苷元、染料木素的提取率和干膏得率的综合评分为评价指标（综合评分＝栀子苷提取率×30/最大栀子苷提取率＋京尼平龙胆双糖苷提取率×20/最大京尼平龙胆双糖苷提取率＋大豆苷元提取率×20/最大大豆苷元提取率＋染料木素提取率×20/最大染料木素提取率＋干膏得率×10/最大干膏得率）。其中1～4号为黄色区域内的点，5～8号为黄色区域外的点，实验安排及结果见表6。由表6可知，黄色区域内工艺点的综合评分优于黄色区域外工艺点的综合评分，因此最终确定提取工艺的最优设计空间为溶剂用量8～11倍、提取时间为30～84 min，提取次数为1～2次。

表3 Plackett-Burman实验设计与结果

Table 3 Experimental design and results of Plackett-Burman

编号X1/minX2/倍X3/minX4Y1/(mg∙g−1)Y2/(mg∙g−1)Y3/(mg∙g−1)Y4/(mg∙g−1)Y5/% 10890349.635.270.450.2428.48 201230130.111.420.210.1015.71 30830341.533.320.360.2023.98 460830123.851.170.170.0815.67 5601290137.492.320.260.1319.45 6601230344.484.160.390.2124.69 760890128.312.010.200.1016.96 801290347.685.560.500.2928.40 90830122.370.970.150.0713.31 1060890345.665.210.440.2428.10 11601230341.773.830.420.2225.60 1201290132.452.390.260.1418.75

表4 Plackett-Burman实验设计方差分析结果

Table 4 Results of variance analysis of Plackett-Burman experimental design

来源Y1Y2Y3 平方和均方FP平方和均方FP平方和均方FP 模型928.499 0232.125 032.540 00.000 029.184 17.296 068.470 00.000 00.166 7 0.041 7185.660 00.000 0 X10.404 00.404 00.060 00.819 00.023 90.023 90.220 00.650 00.000 20.000 20.920 00.370 0 X242.661 042.661 05.980 00.044 00.173 10.173 11.620 00.243 00.006 00.005 926.490 00.001 0 X3114.855 0114.855 016.100 00.005 05.577 05.577 052.340 00.000 00.014 70.014 765.540 00.000 0 X4770.580 0770.580 0108.020 0 0.000 023.410 123.410 1 219.700 00.000 00.145 80.145 8649.680 00.000 0 误差49.936 0 7.134 0 0.745 90.106 6 0.001 60.000 2 失拟项46.278 0 7.713 0 2.110 0 0.483 00.544 50.090 80.450 00.813 00.001 30.000 20.730 00.712 0 合计978.436 0 29.930 0 0.168 2 来源Y4Y5 平方和均方FP平方和均方FP 模型0.058 80.014 7128.550 00.000 0334.793 083.698 0115.240 00.000 0 X10.000 30.000 32.620 00.149 00.279 00.279 00.380 00.555 0 X20.002 10.002 118.670 00.003 03.091 03.091 04.260 00.078 0 X30.005 60.005 649.290 00.000 037.343 037.343 051.410 00.000 0 X40.050 70.050 7443.630 00.000 0294.081 0294.080 0404.890 00.000 0 误差0.000 80.000 1 5.084 00.726 0 失拟项0.000 80.000 80.000 11.930 04.667 00.778 01.860 00.509 0 合计0.0596 339.878 0

图6 标准化效应的pareto图

3 讨论

失眠属中医学“不寐”“不得眠”“目不瞑”等范畴，病因多与情志不遂、饮食不节、久病体虚等有关，病位主要在心，但与肝、胆、脾、胃、肾的阴阳气血失调相关。目前临床治疗失眠的药物有苯二氮类、非苯二氮类、有镇静作用的抗抑郁类、褪黑素受体激动剂类等，短期内，这些药物能显著改善睡眠，但长期使用容易对人体产生很多不利的影响，如地西泮，长期连续用药可产生依赖性和成瘾性[20-21]。栀子豉汤是临床常用的治疗失眠的经典方剂之一，由该方剂组成或衍生的多种方剂对治疗各种类型的失眠均表现出较好的疗效，但其药效物质和作用机制仍不明确。

表5 实验安排及结果

Table 5 Experimental arrangement and results

编号X2/倍X3/minX4Y1/(mg∙g−1)Y2/(mg∙g−1)Y3/(mg∙g−1)Y4/(mg∙g−1)Y5/% 18 (−1)90 (+1)2 (0)45.803.810.330.1925.22 212 (+1)90 (+1)2 (0)45.854.390.380.2225.85 38 (−1)30 (−1)2 (0)35.942.150.270.1519.81 48 (−1)60 (0)3 (+1)47.344.950.390.2326.48 512 (+1)30 (0)2 (0)38.602.380.290.1721.29 610 (0)30 (−1)3 (+1)42.603.300.370.2024.52 710 (0)90 (+1)3 (+1)49.725.500.430.2628.32 810 (0)60 (0)2 (0)42.153.500.340.2024.16 98 (−1)60 (0)1 (−1)27.521.650.160.0914.74 1010 (0)60 (0)2 (0)40.563.450.340.1923.66 1112 (+1)60 (0)3 (+1)45.434.650.450.2726.65 1210 (0)60 (0)2 (0)38.653.300.340.2023.14 1310 (0)60 (0)2 (0)37.143.430.340.1922.74 1410 (0)60 (0)2 (0)40.133.180.330.2023.84 1510 (0)30 (−1)1 (−1)23.211.140.170.0914.25 1612 (+1)60 (0)1 (−1)32.751.830.200.1117.74 1710 (0)90 (+1)1 (−1)32.512.510.210.1117.99

图7 栀子豉汤提取工艺设计空间

本实验采用网络药理学方法对栀子豉汤治疗失眠的成分进行了预测，发现栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷酸、西红花酸、大豆苷元、染料木素等可能是其发挥治疗作用的活性成分。这些活性成分可能作用于IL-6、TNF、IL-1β、ESR1等核心靶标，继而通过神经活性配体-受体相互作用、MAPK信号通路、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路、γ-氨基丁酸能突触、TNF因子信号通路等多条通路治疗失眠。现代药理学研究表明栀子苷能显著缩短实验动物入睡时间，提高实验动物入睡率[22]。但其余成分（如京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷酸、西红花酸、大豆苷元、染料木素）在失眠中的作用仍缺少相关报道。失眠与炎症息息相关，常伴随炎症因子IL-6、TNF、IL-1β表达的升高[23-24]，王丹等[25]研究发现失眠严重程度与IL-6呈正相关，而TNF⁃α对睡眠-觉醒行为存在特异性效应。p38 MAPK是MAPK信号通路的重要组成部分，p38 MAPK信号通路被激活后，促炎因子IL-1β、TNF-α的表达显著升高，并伴随明显炎症的反应，抑制p38 MAPK通过后炎症因子的表达显著下降[26-27]，因此栀子豉汤可能通过调控MAPK信号通路，抑制炎症反应，从而治疗失眠。ESR1通过影响空间记忆和突触可塑性，起到神经保护作用[28]。cAMP被证实可通过蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）参与调节睡眠和昼夜节律，其可使慢波睡眠和总睡眠时间延长，同时缩短入睡潜伏期，具有明显的促睡眠效应[29]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，对维持大脑网络功能至关重要[30]。研究发现失眠患者中枢GABA水平明显降低[31]。

表6 栀子豉汤提取工艺安排及验证结果

Table 6 Extraction process arrangement and verification results of ZD

编号X2/倍X3/minX4Y1/(mg∙g−1)Y2/(mg∙g−1)Y3/(mg∙g−1)Y4/(mg∙g−1)Y5/%综合评分 1960240.403.610.290.1624.0897.43 2960240.213.730.300.1724.2999.86 31061235.413.260.290.1723.2192.66 41061237.733.480.300.1624.1795.45 51130232.312.670.260.1520.9681.92 61130234.032.320.270.1521.1682.07 71145234.592.790.270.1522.5185.56 81145235.052.820.280.1622.4987.90

此外，本研究基于QbD理念，对栀子豉汤提取工艺进行研究，借助网络药理学相关结果、查阅文献以及《中国药典》2020年版对各味中药指标性成分的规定，确定栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、大豆苷元、染料木素为栀子豉汤提取的CQAs，用Plackett-Burman实验设计筛选出溶剂用量、提取时间和提取次数为栀子豉汤提取过程的CPPs，Box-Behnken实验设计对提取工艺进行优化，运用 Monte Carlo法计算栀子豉汤提取工艺的设计空间，最终确定提取工艺最佳范围：溶剂用量8～11倍，提取时间30～84 min，提取次数为1～2次。在设计空间的建立时，采用了达标概率法，通过设定可接受达标概率，建立确保成功概率的设计空间，工艺参数在设计空间内运行，能够保证工艺评价指标达标[32]。本研究运用网络药理学和分子对接技术揭示了栀子豉汤治疗失眠的活性成分、潜在靶点及通路，并通过分子对接技术对筛选出的核心靶点进行验证。可以推测栀子豉汤中的活性成分可能通过作用于IL-6、TNF、IL-1β、ESR1等靶点，调控神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号通路、γ-氨基丁酸能突触、TNF因子信号通路等发挥治疗失眠的作用，可为研究栀子豉汤治疗失眠的分子机制提供思路。通过网络药理学方法和分子对接技术筛选出栀子豉汤的CQAs，运用QbD理念对栀子豉汤的提取工艺参数进行研究，建立设计空间，为该方的进一步开发提供了数据支持。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Research on extraction process of Zhizichi Decoction based on network pharmacology and quality by design concept

HU Zhong-jiao1, 2, ZHENG Lu-lu3, XU Guang-ya4, GUO Xiao-heng4, SHI Zheng1, 2

1. Affiliated Hospital / Clinical Medical College of Chengdu University, Chengdu 610081, China 2. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China 3. College of Food and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China 4. School of Preclinical Medicine, Chengdu University, Chengdu 610106, China

In the present study, we applied network pharmacology to explore the molecular mechanism of Zhizichi Decoction (ZD) in insomnia treatment. To establish and validate the design space for the extraction process of ZD based on the concept of quality by design (QbD).Firstly, the components and corresponding targets of ZD were obtained from TCMSP, PharmMapper, Drugbank, GeneCards, Therapeutic Target Database and OMIM databases. Then, STRING, DAVID database and molecular docking technology were used to analyze potential targets of ZD in the treatment of insomnia. With the extraction yield of geniposide, genipin-1-β--gentiobioside, daidzein, genistein and dry extract yield as critical quality attributes (CQAs). Subsequently, the Placket-Burman experiment design was used to select the critical process parameters (CPPs). The Box-Behnken experiment design was used to optimize the extraction process, and the design space of the ZD extraction process was established.The main active components of ZD, such as geniposide, genipin-1-β--gentiobioside, daidzein and genistein, through acting on the core targets of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), estrogen receptor 1 (ESR1), nitric oxide synthase 3 (NOS3), and involved in the regulation of neuroactive ligand-receptor interaction, GABAergic synapse, TNF signaling pathway, thereby treating insomnia. The design space of extraction technology of ZD was as follows: The amount of solvent was 8—11 times, the extraction time was 30—84 min, and the number of extraction was 1—2 times.ZD may treat insomnia through multiple components, multiple targets and multiple pathways. The design space of extraction process of ZD based on QbD concept was robust and reliable, which would provide reference for the process development of its formulations.

Zhizichi Decoction; network pharmacology; insomnia; molecular docking; quality by design; design space; extraction process; geniposide; genipin-1-β--gentiobioside; daidzein; genistein; interleukin-1β; interleukin- 6; estrogen receptor 1; nitric oxide synthase 3

R284.2

A

0253 - 2670(2022)07 - 1973 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.006

2021-10-11

国家自然科学基金项目（81803561）；四川省科技计划项目（2020YJ04087）；四川省中医药管理局科研专项课题（2021MS189）；成都市金牛区医学会科研课题（JNKY2021-06）；成都大学附属医院院级课题（Y2021006）；成都市医学科研课题（2021070）；龙泉驿英才计划C类创新人才计划；四川省科技厅农业科技成果转化资金项目（22NZZH0031）

胡钟姣（1994—），女，硕士研究生，研究方向为临床药学。Tel: 15761639978 E-mail: huzhongjiao219@163.com

时 政，硕士生导师，教授，主要从事中药新药研发及中药质量标准研究。E-mail: drshiz1002@hotmail.com

[责任编辑 郑礼胜]