僵蚕溶茧酶抑制剂的纯化与抗肿瘤活性研究

王厚伟，徐凌川，王家超，曾英姿，田景振，窦彦玲，王 飞

僵蚕溶茧酶抑制剂的纯化与抗肿瘤活性研究

王厚伟1，徐凌川1，王家超3，曾英姿4，田景振1，窦彦玲2*，王 飞5

1. 山东中医药大学药学院，山东 济南 250355 2. 山东中医药大学智能与信息工程学院，山东 济南 250355 3. 河北医科大学基础医学院，河北 石家庄 050017 4. 山东沃华医药科技有限公司，山东 潍坊 261061 5. 御华景宸（山东）康养发展集团有限公司，山东 济南 250000

分离纯化僵蚕溶茧酶抑制剂（Jiangcan cocoonase inhibitor，JCCI），研究其体内外对人肝癌SMCC-7721细胞增殖的抑制活性。依次应用以家蚕溶茧酶为配体的亲和色谱、Sephadex G-50凝胶过滤色谱、Superdex 75快速蛋白液相色谱（fast protein liquid chromatography，FPLC），从僵蚕粗蛋白提取物的85%硫酸铵沉淀物中分离纯化JCCI。以Edman降解法测其端氨基酸序列。应用MTT法与荷瘤裸鼠模型，检测其体内外抑制SMCC-7721细胞增殖与生长活性。JCCI相对分子质量为13 973.63，其端前10个氨基酸序列为VRNKRQSNDD。抑制剂动力学分析结果表明，JCCI是溶茧酶的非竞争性抑制剂，米氏常数（m）平均值为76.50，二者物质的量之比为1∶1。JCCI可显著抑制SMCC-7721肝癌细胞体外增殖与体内荷瘤裸鼠的肿瘤生长，体外给药36 h的半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）为260.52 μg/mL，JCCI抑制率与剂量线性相关。JCCI是一种首次从僵蚕中分离纯化的具有抗肿瘤活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂。

僵蚕；溶茧酶；丝氨酸蛋白酶抑制剂；抗肿瘤活性；肝癌；亲和色谱；荷瘤裸鼠；MTT法

僵蚕是蚕蛾科昆虫家蚕Linnaeus 4～5龄的幼虫感染白僵菌(Bals.) Vuillant而致死的干燥体，被列入《中国药典》2020年版，具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结等功效[1]。僵蚕单独或与其他中药配伍用于治疗多种肿瘤疾病[2]。在我国的一些地区僵蚕作为一种民间药用于治疗癌症[3]。关于僵蚕的抗肿瘤作用已有一些文献报道。僵蚕水煎煮提取物对小鼠肉瘤S180细胞[4]、小鼠艾氏腹水瘤细胞以及人肝癌细胞体外增殖有抑制作用[5]；ig僵蚕水煎剂，制备大鼠含药血清，该血清能抑制肝癌Hepa1-6细胞体外增殖与侵袭[6]；僵蚕乙醇提物对体外培养的HeLa细胞增殖具显著抑制作用[7]；僵蚕中麦角甾醇、β-谷甾醇、棕榈酸3种成分具有抑制小鼠黑素瘤B16-F10细胞和人黑色素瘤A375细胞增殖活性[8]。

丝氨酸蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物体内，在医学领域作为一类有前景的癌症治疗候选药物已得到普遍认可[9-10]。肿瘤细胞外基质中丝氨酸蛋白酶活性与肿瘤浸润和转移密切相关[11]。一些文献报道了丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制肿瘤细胞的浸润和转移作用[12-16]。人肝癌细胞膜上存在丝氨酸蛋白酶抑制剂受体，抑制剂与之结合能够调节基质丝氨酸蛋白酶的活性，抑制蛋白酶对基质蛋白的分解作用，修复细胞屏障，阻断肿瘤细胞的浸润和转移[17-18]。

家蚕溶茧酶是家蚕蛹羽化成蛾后由蚕蛾的下颚合成分泌的一种丝氨酸蛋白酶，用于溶解茧丝，在封闭的茧壳上形成羽化孔，以帮助蚕蛾脱茧而出。本课题组前期已完成了家蚕蛾溶茧酶（GenBank：BAJ46146.1）的分离纯化及其基因的克隆与表达[19]。本研究拟应用以家蚕蛾溶茧酶为配体的亲和色谱技术作为主要分离手段，从僵蚕水提取物中分离纯化小相对分子质量丝氨酸蛋白酶抑制剂，研究抑制剂的理化性质、酶学特性及其体内、外抑制人肝癌SMCC-7721细胞增殖活性，分析它的丝氨酸蛋白酶抑制活性与抗肿瘤活性的关系与机制。迄今为止，僵蚕小相对分子质量蛋白组分的抗肿瘤活性未见报道，本研究为白僵蚕在中医临床上用于肿瘤性疾病的治疗，以及应用僵蚕溶茧酶抑制剂（Jiangcan cocoonase inhibitor，JCCI）治疗肝癌提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

H1850R高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），FD-1D-80冷冻干燥机（上海比朗仪器制造有限公司），快速蛋白质液相色谱仪（ÄKTA Pure，GE医疗生命科学），4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer、ABI 491A氨基酸测序仪（应用生物系统公司，美国），3550酶标仪 [伯乐生命医学产品（上海）有限公司，美国]。

1.2 实验动物

无特定病原体的BALB/c裸鼠由山东中医药大学实验动物中心（济南，中国）提供，质量合格许可证编号：SYXK（鲁）2017-0022。本研究严格按照国家卫生研究院实验动物护理和使用指南（2015年，第9版）中的建议进行。《动物使用方案》经山东中医药大学（济南）动物管理与使用委员会审定（批准号SDUTCM20200303002）。

白僵蚕是根据《中国药典》2020年版一部的炮制规范由本实验室专门制备。应用纯种白僵菌株(Bals.) Vuillant（山东中医药大学徐凌川教授鉴定）感染第4龄第2天的家蚕，家蚕品种为“菁松”ד皓月”的一代杂交种，常规桑叶育，收集病死的尸体，于烘箱中40 ℃干燥制得。

1.3 材料

SMCC-7721细胞（中国科学院生物化学与细胞生物学研究所），DMEM培养基、胎牛血清、氨苄青霉素、链霉素（Gibco-BRL），牛血清白蛋白（默克西格玛公司，美国），CNBr-active Sepharose CL-4B、Sephadex G-50、Superdex 75 Increase 10/300 G L（法玛西亚公司，瑞典），α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA，默克西格玛公司，美国），-苯甲酰--精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐（BApNA，默克西格玛公司），Ultra-46K（默克密理博公司），MTT（默克西格玛公司），SPSS13.0软件（SPSS，Inc.，美国）。

2 方法

2.1 JCCI的提取与分离

2.1.1 JCCI的提取 取适量新制备的白僵蚕粉加入10倍体积的提取缓冲液（50.00 mmol/L，pH 8.0，Tris-HCl缓冲液），匀浆提取，离心（10 000 r/min，10 min），收集上清液。沉淀物重复提取2次，合并3次上清液，冷冻干燥，得白僵蚕粗蛋白冻干粉，称定质量，备用。

2.1.2 JCCI的硫酸铵分步盐析法分离 取适量上述白僵蚕冻干粉溶于适量的提取缓冲溶液中，离心（10 000 r/min、10 min），收集上清液，缓慢加入硫酸铵调节饱和度至25%，25 ℃下温和搅拌30 min，离心（10 000 r/min、10 min），收集沉淀物，得25%饱和度的硫酸铵沉淀。上清液重复以上操作，得55%、85%饱和度的硫酸铵沉淀。各沉淀物于4 ℃下透析36 h，离心（10 000 r/min、10 min），上清液冷冻干燥，测溶茧酶抑制活性。具有最高溶茧酶抑制活性的硫酸铵沉淀物冻干粉即为JCCI。

2.2 蛋白质含量测定

使用Lowry蛋白质测定方法[20]，用牛血清白蛋白作为标准品测定蛋白质含量。

2.3 JCCI的抑制活性分析

参照文献方法[21]，溶茧酶属类胰蛋白酶，以-苯甲酰--精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐（BApNA）为底物，检测JCCI对溶茧酶的抑制活性。应用反应缓冲液（50.00 mmol/L、pH 8.0、Tris HCl，10.00 mmol/L CaCl2）配制14.00、28.00、42.00、56.00、70.00、84.00、98.00 μg/mL系列质量浓度JCCI溶液（相当于1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 nmol/mL）。取1.00 mL各浓度JCCI溶液，分别与2.00 mL溶茧酶溶液（2.50 nmol/mL）混合，37 ˚C保温10 min后加入100 μL BApNA溶液（10.00 mmol/L），继续37 ℃保温5 min后，用0.40 mL 33%乙酸溶液终止反应，测410 nm吸光度（410）值。对照组以相同体积的反应缓冲液代替抑制剂样品溶液。1个溶茧酶的酶活力单位定义为使410值增加0.01所需酶的物质的量，1个JCCI抑制活力单位则为使410值降低0.01所需抑制剂的物质的量。

2.4 亲和色谱

2.4.1 亲和配体的制备 选择家蚕溶茧酶作为亲和色谱的配体。溶茧酶是家蚕蛾在羽化的过程中分泌的一种丝氨酸蛋白水解酶，用于水解蚕茧先端形成羽化孔，使蚕蛾脱茧而出，参照文献方法[19]纯化制备溶茧酶配体。

2.4.2 亲和载体的制备 根据制造商说明书（2018版），将CNBr活化的Sepharose CL-4B与适量的溶茧酶偶联，制成亲和载体。

2.4.3 亲和色谱 适量粗JCCI溶于适量平衡缓冲溶液（50.00 mmol/L、pH 8.0、Tris HCl）中，4 ℃离心（10 000 r/min、10 min），上清液加样于亲和色谱柱（20.00 cm×1.60 cm，柱体积约35.00 mL，柱床高17.00 cm），37 ℃保温1 h，依次用含1.00 mol/L NaCl的平衡缓冲液、蒸馏水、氯化氢溶液（pH 2.4）洗柱，收集洗脱液，用Tris碱（2.00 mol/L）中和，重复加样，合并Tris碱中和液，透析，冻干。

2.5 凝胶过滤色谱

亲和色谱冻干粉以适量洗脱液（50.00 mmol/L Tris HCl缓冲液，pH 8.0）溶解，加样于Sephadex G-50凝胶过滤色谱柱（60.00 cm×1.60 cm，柱体积约114.00 mL，柱床高56.00 cm），洗脱液体积流量1.00 mL/min，检测各洗脱峰的溶茧酶抑制活性。

2.6 快速蛋白质液相色谱（FPLC）分析

以上JCCI活性蛋白峰进一步做Superdex 75 Increase 10/300 G L FPLC分析，用2倍体积的50 mmol/L pH 8.0 Tris HCl缓冲液平衡色谱柱，上样后收集1.2倍柱体积的洗脱液，每管1 mL，体积流量0.50 mL/min，检测280 nm的紫外吸光度值，蛋白峰用Ultra-46K浓缩。检测各洗脱峰溶茧酶抑制活性。活性蛋白峰用SDS-PAGE检测蛋白纯度，纯化的样品−80 ℃保存。

2.7 SDS-PAGE分析

参照文献方法[22]进行SDS-PAGE分析，凝胶浓度为12%，用考马斯亮蓝R-250染色。

2.8 飞行时间质谱分析

吸取10 μL 1.00 mg/mL的JCCI样品与10 μL 5.00 mg/mL的α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）混匀。取1 μL混合液滴于进样深头，抽真空除去溶剂，用4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer进行质谱分析，激光光源为355 nm Nd：YAG激光器，加速电压2 kV，正离子反射检测模式。

2.9 JCCI的N端氨基酸序列分析

参照文献方法[21]，应用ABI 491A氨基酸测序仪，以Edman降解法测定JCCI的端10个氨基酸序列。

2.10 JCCI的动力学分析

配制2.00 nmol/mL（28.00 μg/mL）和3.00 nmol/mL（42.00 μg/mL）的JCCI溶液，各取1.00 mL分别与2.00 mL 60.00 μg/mL的溶茧酶溶液（相当于2.50 nmol/mL）混合，分别加入2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、14.00、16.00、18.00 μL的底物BApNA溶液（10.00 mmol/L），保温5 min后用0.50 mL 33 %的乙酸溶液终止反应，测定410值，应用Origin 2018 64bit软件中抑制剂动力学分析子程序，直接以MichaelisMenten模型作图，计算米氏常数（m）、最大反应速度（max）、抑制常数（K）。

2.11 细胞培养

SMCC-7721细胞用含10%胎牛血清，100 U/mL氨苄青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。当SMCC-7721细胞贴壁并长满培养瓶侧壁时，用胰蛋白酶消化处理后作传代培养。

2.12 MTT检测

取对数生长期SMCC-7721细胞接种到96孔细胞培养板，接种密度为1×105个/mL，每孔100.00 μL，培养24 h后给药，JCCI质量浓度分别为500.00、250.00、100.00 μg/mL，每个剂量设置6个复孔，给药36 h后，加入10.00 μL 5.00 g/L的MTT，继续培养4 h，吸除各培养孔上清后，加入150.00 μL DMSO充分溶解，用酶标仪测定各培养孔490 nm处值。按公式计算细胞生长抑制率，并应用SPSS 13.0软件计算JCCI的IC50。

细胞生长抑制率＝1－给药组平均值/对照组平均值

2.13 体内抗肿瘤活性检测

用DMEM调配对数生长期的SMCC-7721的细胞密度为5.00×106/mL。取0.10 mL的细胞悬液于背部sc于6只BALB/C裸鼠，根据肿瘤生长状况饲养约20 d后处死小鼠，选择生长良好的肿瘤组织，切成小块（质量约40.00 mg），加入0.20 mL生理盐水，用穿刺针移植于裸鼠左侧腋窝，约1周后将肿瘤生长良好的荷瘤裸鼠随机分为5组，每组6只。阴性对照组于瘤周sc 0.20 mL生理盐水（10.00 mL/kg），每天1次；阳性对照组于瘤周sc 16.00 μL的5-氟嘧啶（5-Fu）注射液原液（25.00 mg/mL），隔天1次，注射剂量为20.00 mg/kg；给药组分低、中、高3个JCCI剂量组，分别于瘤周sc 0.20 mL用生理盐水溶解的JCCI药液，每天1次，注射剂量分别为50.00、25.00、12.50 mg/kg。连续给药14 d后，比较各组肿瘤质量，计算肿瘤抑制率。各组裸鼠处死前称定质量，处死后无菌采集各组裸鼠脾脏称定质量，计算脾脏指数。

脾脏指数＝10×脾脏质量/体质量

2.14 统计分析

JCCI处理组间差异比较应用SPSS软件做均匀方差分析与检验，实验数据用表示，＜0.05表示有统计学显著差异。

3 结果

3.1 JCCI的提取与分离

按照“2.1”项方法，取2.00 g冻干粉应用分步盐析法分离得到不同饱和度的硫酸铵沉淀物，按照“2.2”项方法检测各沉淀物的蛋白质含量，按照“2.3”项方法检测溶茧酶抑制活性。结果显示（表1），JCCI溶茧酶抑制活性主要存在于55%和85%的硫酸铵沉淀物中，但后者的比抑制活力是前者的1.43倍，而且55%硫酸铵沉淀物的比抑制活力（1.45 U/mg）与总硫酸铵沉淀物比抑制活力（1.40 U/mg）相近，纯化倍数仅为1.04。因此，本研究将僵蚕总水溶性蛋白的85%硫酸铵沉淀物指定为JCCI粗蛋白。以此为基础进行纯化处理。

3.2 JCCI的纯化

按照“2.4”项方法，取300 mg JCCI粗蛋白做亲和色谱纯化。图1-A上图显示2个蛋白峰，第1个峰在8～15号收集管，为盐洗脱峰，该峰经检测无溶茧酶抑制活性；第2个峰在25～30号管，为具有显著JCCI活性的亲和吸附峰。

按照“2.5”项方法，应用Sephadex G‑50对亲和色谱的25～30号管收集夜做进一步的凝胶过滤色谱纯化。图1-A下图显示主蛋白峰在21～25号收集管，具有显著的溶茧酶抑制活性，在主蛋白峰前面的5～20号收集管存在4个很小的杂蛋白峰，均无JCCI活性。主蛋白峰的22～24号管经12% SDS-PAGE纯度分析，显示单一蛋白条带，纯度大于90%。

合并22～24号收集管组分，按照“2.6”项方法进行FPLC分析。图1-C显示在洗脱时间25～30 min出现蛋白主峰，合并收集主峰组分，获得纯化的JCCI。12% SDS-PAGE分析结果（图1-B）显示在相对相对分子质量1.0×104～1.5×104存在单一蛋白主带。飞行时间质谱分析结果（图1-D）表明，JCCI相对分子质量为13 973.63。

表1 JCCI粗蛋白盐析分离及其溶茧酶抑制活性检测

Table 1 Isolation of JCCI crude protein by salt fractionation with(NH4)2SO4 and determination of its inhibitory activity

组分蛋白含量/mg抑制活力/U比抑制活力/(U·mg−1)蛋白回收率/% 25%硫酸铵沉淀物275.6857.830.2113.78 55%硫酸铵沉淀物491.45713.431.4524.57 85%硫酸铵沉淀物442.79917.392.0722.14 总硫酸铵沉淀物1 209.921 688.651.4060.50

A-上图为亲和色谱图，下图为凝胶过滤色谱图 B-SDS-PAGE（泳道M为蛋白质相对分子质量标记；泳道1～4为JCCI粗蛋白，上样量分别为25、20、15、10 μL；5、6为亲和色谱样品；7为凝胶过滤色谱样品；8为FPLC样品） C-快速蛋白质液相色谱图 D-飞行时间质谱图

由表2可见，JCCI粗蛋白经亲和色谱分离后比抑制活力增加了9.30倍，是JCCI纯化的关键步骤。Sephadex G-50凝胶过滤色谱分离使比抑制活力进一步提升了1.32倍，获得基本纯化的JCCI单一成分。尽管FPLC步骤的纯化倍数提升不显著，但使JCCI纯度进一步提高，满足端氨基酸测序分析要求。JCCI粗蛋白经3步色谱分离，获得能够满足端氨基酸测序分析要求的JCCI单体，总纯化倍数提升了13.01，总抑制活力回收率为86.26%，蛋白回收率为6.64%。

3.3 JCCI的N端氨基酸序列与同源性

按照“2.9”项方法，JCCI样品经PAGE电泳后转膜，剪下主带，应用Edman降解法测序，获得JCCI的端10个氨基酸序列：VRNKRQSNDD（缬氨酸·精氨酸·天冬酰胺·赖氨酸·精氨酸·谷氨酰胺·丝氨酸·天冬酰胺·天冬氨酸·天冬氨酸）。应用BLASTp程序检索NR数据库，设定值范围为0～100，共检索到6个100%相似度蛋白（表3）。以Grishin（protein）为距离采用Fast Minimum Evolution方法建立系统发育树，JCCI与一种家蚕蛾蛋白酶抑制剂（NP_001040294.1）、一种野桑蚕未表征蛋白（XP_028028609.1）、一种黄杆菌BFFFF2蛋白高度同源，但4者相对分子质量不同，不是同种蛋白。本研究从中药僵蚕中分离纯化出JCCI属首次报道，根据NP_001040294.1推测的JCCI的全长氨基酸序列与cDNA编码序列汇总见图2。

表2 JCCI的纯化步骤

Table 2 Purification steps of JCCI

纯化步骤蛋白含量/mg抑制活力/IU抑制活力回收率/% 比抑制活力/(U·mg−1) 85%硫酸铵沉淀300.00621.59100.002.07 亲和色谱29.29563.5890.6719.24 Sephadex G-50凝胶过滤色谱21.38541.3387.0925.32 FPLC19.91536.1886.2626.93

3.4 JCCI对溶茧酶活性的抑制作用与动力学分析

如图3-A所示，在含5 nmol/L溶茧酶的反应体系中，JCCI在0～5.00 nmol/L对溶茧酶抑制活性线性相关，二者物质的量抑制比约为1∶1，质量抑制比约为1∶1.71。

如图3-B所示，3种JCCI浓度（0、2.00、3.00 nmol/L）反应体系的m值相近，分别为76.76、76.40、76.35，而max值则随JCCI含量增加而下降，分别为46.50、27.76、18.53单位。因此，JCCI为溶茧酶的非竞争性抑制剂。

3.5 JCCI对SMCC-7721细胞体外增殖抑制作用

SMCC-7721细胞贴壁生长24 h后给药，给药36 h后MTT法测各培养孔490。表4显示，JCCI对SMCC-7721增殖具有显著抑制作用，抑制活性呈现浓度相关效应。应用逻辑回归求得JCCI在给药36 h后的IC50为260.52 μg/mL。

表3 JCCI的N端氨基酸序列BLASTp相似度检索结果汇总(E值0～100)

Table 3 BLASTp similarity of the JCCI N-terminal amino acid sequence (E value 0—100)

登录号科学名称总得分E值相似度/%序列 QueryBombyx Batryticatus100.00100.001 VRNKRQSNDD 10 XP_028028609.1Bombyx mandarina35.40.53100.0021 VRNKRQSNDD 30 NP_001040294.1Bombyx mori35.40.55100.0021 VRNKRQSNDD 30 OYU82547.1Flavobacterium sp. BFFFF232.08.90100.00114 VRNKRQSND 122 XP_017783957.1Nicrophorus vespilloides29.950.0088.8923 IRNKRQSND 31 KAF2887618.1Ignelater luminosus29.951.0088.8996 RNKRQANDD 104 XP_028400913.1Dendronephthya gigantea29.198.00100.00636 NKRQSNDD 643

图2 JCCI的氨基酸序列及其cDNA编码序列

v0-5.00 nmol·L−1溶茧酶 v2-5.00 nmol·L−1溶茧酶和2.00 nmol·L−1 JCCI v3-5.00 nmol·L−1溶茧酶和3.00 nmol·L−1 JCCI

表4 JCCI对SMCC-7721细胞体外增殖的抑制作用()

Table 4 Inhibitory effect of JCCI on the in vitro proliferation of SMCC-7721 cells()

组别剂量/(μg.mL−1)A490抑制率/% 对照 00.697±0.017 JCCI1000.531±0.034**24 2500.389±0.029**44 5000.195±0.025**72

与对照组比较：**＜0.01

**< 0.01control group

图4为500 μg/mL JCCI给药36 h的细胞形态。JCCI给药组细胞贴壁面积收缩减少，细胞核固缩，细胞质粗糙，核分裂较少，细胞数量与对照相比显著减少，大量细胞悬浮死亡。而对照组细胞外部形态正常，贴壁生长良好。

A-对照 B-JCCI处理

3.6 JCCI对SMCC-7721细胞体内增殖抑制作用

以5-Fu为阳性对照药物，以瘤周sc方式给药，JCCI对SMCC-7721移植瘤生长影响结果见表5。JCCI能够明显抑制SMCC-7721移植瘤细胞生长，抑制活性呈现剂量依赖性。与对照组相比，JCCI低剂量组的抑瘤率有所降低，但无差异显著性，JCCI中、高剂量组和阳性药物组的抑瘤率显著高于对照组。JCCI中剂量组与5-Fu组相比抑瘤率无显著差异，但JCCI高剂量组的抑瘤率显著高于5-Fu组。JCCI各剂量组对裸鼠脾脏指数影响差异不显著。

4 讨论

僵蚕在中医临床上具有熄风、祛风之功效[1]。中医理论认为“内风”善行数变是引起肝癌转移的关键病机之一，并有相关“风药”抗肿瘤作用的报道[23-25]。尽管僵蚕抗肿瘤物质基础与作用机制已有诸多研究[2-10]，但有关僵蚕抗肿瘤活性蛋白的研究未见报道。本课题组在前期研究中分离得到一种具有家蚕溶茧酶抑制活性的僵蚕蛋白组分，推测该组分与僵蚕的抗肿瘤活性密切相关。为此，本研究进一步应用以溶茧酶为配体的亲和色谱、Sephadex G-50凝胶过滤色谱，以及FPLC技术，从僵蚕粗蛋白的85%硫酸氨沉淀物中纯化出JCCI，纯化的JCCI经SDS-PAGE检测显示单一条带，FPLC呈单一对称的色谱主峰，进一步对JCCI做了抑制活性动力学分析，观测了JCCI对SMCC-7721细胞的体内、外增殖的影响，旨在为中药僵蚕抗肿瘤临床应用与抗肝癌新药研发奠定基础。

表5 JCCI对SMCC-7721荷瘤裸鼠肿瘤质量和脾脏指数的影响()

Table 5 Tumor inhibition rate of JCCI on SMCC-7721 cells in tumor‑bearing mice and the spleen coefficient()

组别剂量/ (mg·kg−1)肿瘤质量/g抑瘤率/%脾脏指数/(mg·g−1) 对照00.38±0.1905.27 5-Fu20.00.29±0.16*23.685.18 JCCI12.50.35±0.14 9.685.36 25.00.27±0.11*31.435.63 50.00.23±0.09*# 55.56#5.44

与对照组比较：*＜0.05；与阳性药物组比较：#＜0.05

*< 0.05control group#< 0.05positive drug group

以溶茧酶为配体的亲和色谱是JCCI分离纯化的技术核心，亲和配体源自家蚕蛾在羽化过程中合成分泌的一种丝氨酸蛋白酶—溶茧酶，纯化的JCCI属于一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。在亲和色谱过程中，需先将上样后的色谱柱在37 ℃条件下保温处理1～1.5 h，以水解去除与亲和配体非特异性结合的底物蛋白，然后再用1 mol/L NaCl溶液洗柱，以洗掉绝大部分与凝胶介质非特异性结合的杂蛋白，最后用pH 2～3的盐酸溶液洗柱，获得含少量杂质的JCCI。在Sephadex G-50凝胶过滤色谱过程中，JCCI的活性主峰位于20～25号收集管，但在主峰前面有一小的杂蛋白峰与主峰未完全分开，为保证JCCI的纯度可在收集过程中仅将23～25号管的收集液合并，用于下一步的FPLC分析。应用ABI-491A氨基酸测序仪以Edman降解法测序对样品蛋白纯度要求很高，为确保测序成功，将FPLC主峰收集液经PAGE电泳后进一步电转膜，剪下PVDF膜上的主带用于测序分析，测得JCCI的N端前10个氨基酸序列为“VRNKRQSNDD”。

蛋白质端5～10个氨基酸序列通常是其特征性标签序列。根据应用BLASTp程序检索nr数据库的同源性比较结果和系统发育树，JCCI与一种家蚕蛾蛋白酶抑制剂前体（NP_001040294.1）高度同源，NP_001040294.1的21～30位氨基酸序列与JCCI的1～10位序列完全相同。根据Suetsugu等[26]对家蚕大规模全长cDNA测序结果，NP_001040294.1全长含148个氨基酸残基，但从第21位氨基酸残基开始计算的相对分子质量与JCCI的飞行时间质谱测定的相对分子质量完全相同，均为13 973.63。由此判断JCCI是家蚕NP_001040294.1蛋白缺失了N端20个氨基酸残基的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，该抑制剂含128个氨基酸残基，等电点为8.01。本研究从中药僵蚕中分离纯化出JCCI属首次报道。

JCCI对SMCC-7721细胞体外增殖与荷瘤裸鼠的肿瘤生长具有显著抑制作用，抑制率呈线性剂量效应。因此，JCCI是僵蚕中一种具有抗肿瘤活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂。肿瘤细胞外基质屏障的降解是肿瘤细胞生长和浸润过程中的关键环节，它与基质中丝氨酸蛋白酶活性密切相关[15]，而人肝癌细胞存在丝氨酸蛋白酶抑制剂受体，能够调节基质丝氨酸蛋白酶的活性，抑制蛋白酶对基质蛋白的分解作用[15]。由此推测，JCCI可能与SMCC-7721胞膜外侧的丝氨酸蛋白酶抑制剂受体结合，抑制基质蛋白酶活性，通过阻断细胞外基质屏障的降解，影响肿瘤细胞的浸润扩散过程，从而发挥对SMCC-7721细胞体内外生长的抑制作用。

JCCI在体内外对SMCC-7721细胞增殖抑制作用显示了良好的抗肿瘤药物研发前景。但JCCI能否直接抑制与阻断SMCC-7721的转移与侵袭及其作用靶点与机制尚需进一步明确。本研究下一步将设计合成兼并引物以完成JCCI的cDNA序列克隆与表达，研究JCCI对肿瘤相关信号通路的影响，以深入探讨其抗肿瘤作用机制，为论证JCCI抗肿瘤相关临床应用研发的可行性奠定基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 中国药典 [S]. 一部. 2020: 375

[2] 王居祥, 朱超林, 戴虹. 僵蚕及僵蛹的药理研究与临床应用 [J]. 时珍国医国药, 1999, 10(8): 637-639.

[3] 李军德, 姜凤梧. 我国抗癌动物药概述 [J]. 中成药, 1992, 14(2): 40-42.

[4] Jiang X, Zhang Z F, Chen Y J,. Structural elucidation andantitumor activity of a novel oligosaccharide from[J]., 2014, 103: 434-441.

[5] Cho H D, Min H J, Won Y S,. Solid state fermentation process withenhances the cancer-suppressive potential of silkworm larva in hepatocellular carcinoma cells [J]., 2019, 19(1): 241.

[6] Yuan L Y, Bing Z T, Han J N,. Study on the anti-tumor mechanism related to immune microenvironment ofon viral and non-viral infections of hepatocellular carcinoma [J]., 2020, 124: 109838.

[7] Wu W P, Cao J, Wu J Y,. Anticancer activity ofethanol extract against the human tumor cell line HeLa [J]., 2015, 14(1): 79-88.

[8] 程杏安, 蒋旭红, 刘展眉, 等. 僵蚕七种化学成分抗肿瘤活性的初步研究 [J]. 仲恺农业工程学院学报, 2015, 28(4): 35-39.

[9] Jiang L, Wang Y J, Zhao J,. Direct tumor killing and immunotherapy through anti-SerpinB9 therapy [J]., 2020, 183(5): 1219-1233.e18.

[10] Wang L, Cao X Y, Li B MFunction of serine protease inhibitor in tumor cell migration [J]., 2019, 6(12): 1518-1523.

[11] Peng S, Du T, Wu W,. Decreased expression of serine protease inhibitor family G1 (SERPING1) in prostate cancer can help distinguish high-risk prostate cancer and predicts malignant progression [J]., 2018, 36(8): 366.e1-366.e9.

[12] Mehner C, Oberg A L, Kalli K R,. Serine protease inhibitor Kazal type 1 (SPINK1) drives proliferation and anoikis resistance in a subset of ovarian cancers [J]., 2015, 6(34): 35737-35754.

[13] Takahashi H, Funahashi H, Sawai H,. Synthetic serine protease inhibitor, gabexate mesilate, prevents nuclear factor-kappaB activation and increases TNF-alpha-mediated apoptosis in human pancreatic cancer cells [J]., 2007, 52(10): 2646-2652.

[14] Maass N, Hojo T, Zhang M,. Maspin: a novel protease inhibitor with tumor-suppressing activity in breast cancer [J]., 2000, 39(8): 931-934.

[15] 李夏, 曾名勇, 董士远, 等. 胰蛋白酶抑制剂及其抗肿瘤活性研究进展 [J]. 食品研究与开发, 2007, 28(4): 163-166.

[16] 田启航, 李杰. 基于细胞焦亡探讨中医药干预肿瘤炎性微环境的新机制[J]. 世界中医药, 2020, 15(12): 1814-1818.

[17] Ying H Y, Gong C J, Feng Y,. Serine protease inhibitor Kazal type 1 (SPINK1) downregulates E-cadherin and induces EMT of hepatoma cells to promote hepatocellular carcinoma metastasis via the MEK/ERK signaling pathway [J]., 2017, 18(6): 349-358.

[18] Ge K K, Huang J J, Wang W,. Serine protease inhibitor kazal-type 6 inhibits tumorigenesis of human hepatocellular carcinoma cells via its extracellular action [J]., 2017, 8(4): 5965-5975.

[19] 王厚伟. 家蚕蛾溶茧酶的分离纯化及其基因克隆与表达 [D]. 成都: 四川农业大学, 2005.

[20] Loewenberg J R. Cyanide and the determination of protein with the Folin phenol reagent [J]., 1967, 19(1): 95-97.

[21] Al-Tubuly A A. SDS-PAGE and western blotting [J]., 2000, 40: 391-405.

[22] Edman P. A method for the determination of amino acid sequence in peptides [J]., 1949, 22(3): 475.

[23] 赵海燕, 李静益. 连建伟运用风药治疗消化系统肿瘤经验[J]. 浙江中西医结合杂志, 2019, 29(5): 349-351.

[24] Xia M J, Yang F M, Zhao C,.Discussion on wind-drugs in the treatment of tumor [J]., 2017, 58(2): 115-118.

[25] Li Y Y, Xiao B Y, He Y H. Research progress on anti-tumor effect of wind medicine [J]., 2011, 36(23): 3375-3379.

[26] Suetsugu Y, Futahashi R, Kanamori H,. Large scale full-length cDNA sequencing reveals a unique genomic landscape in a lepidopteran model insect,[J]., 2013, 3(9): 1481-1492.

Research on purification of cocoonase inhibitor ofand its anti-tumor activity

WANG Hou-wei1, XU Ling-chuan1, WANG Jia-chao3, ZENG Ying-zi4, TIAN Jing-zhen1, DOU Yan-ling2, WANG Fei5

1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. School of Intelligence and Information Engineering, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 3. School of Basic Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China 4. Shandong Wohua Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Weifang 261061, China 5. Yuhua Jingchen (Shandong) Health Development Group Co., Ltd., Jinan 250000, China

To isolate and purify the cocoonase inhibito ofr (Jiangcan, JCCI), and study its anti-tumor activity of SMCC-7721 liver cancer cellsand.JCCI was purified from the 85% ammonium sulfate precipitate of the crude protein extract ofby affinity chromatography with silkworm cocoonase as ligand, Sephadex G-50 gel filtration chromatography, and Superdex 75 FPLC. The JCCI N-terminal amino acid sequence was determined by Edman degradation method. MTT method and tumor-bearing nude mouse model were used to detect the inhibiting effect of JCCI on the proliferation and growth of SMCC-7721and.The molecular weight of JCCI was 13 973.63 Daltons, and the first 10 amino acid sequence of its N-terminal was VRNKRQSNDD. JCCI was a non-competitive cocoonase inhibitor, with an average Km of 76.50 and a molar inhibition ratio of 1∶1. JCCI could significantly inhibit the proliferation of SMCC-7721and the tumor growth of tumor-bearing nude mice. The IC50was 260.52 μg/mL after 24 h administration, and the inhibition rate was linearly related to the dose of JCCI.JCCI was a serine protease inhibitor with anti-tumor activity purified fromfor the first time.

; cocoonase; serine protease inhibitor; anti-tumor activity; liver cancer; affinity chromatography; tumor-bearing nude mice; MTT method

R284.1

A

0253 - 2670(2022)07 - 2022 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.011

2021-10-28

山东省自然科学基金资助项目（ZR2013HM035）；山东省重点产业关键技术资助项目（2016CYJS08A01-8）；济南科技发展计划资助项目（201102021）；山东省高校科技计划资助项目（J11LF29）

王厚伟，硕士生导师，副教授，从事基于药性理论的中药生物技术新药研发。Tel/Fax: 13791138419 E-mail: houweiw@163.com

窦彦玲，副教授，从事计算机科学与技术研究。Tel/Fax: 15864533191 E-mail: yanlingdou@163.com

[责任编辑 王文倩]