血液中氨基酸水平与三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效相关性分析

杨丰源，李锦成

(1.锦州医科大学；2.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000)

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，全世界范围内其发病率居高不下，尽管诊断技术不断改进，创新药物陆续上市使乳腺癌诊疗水平逐渐提高，然而乳腺癌仍是女性癌症死亡的主要原因[1]。不同分子类型的乳腺癌表现出明显的异质性，具有不同的生物学行为。我们根据患者临床及病理的不同特征进行乳腺癌的分子分型，并且在分子和遗传水平上进行了广泛的基础研究，以便对乳腺癌患者进行个体化的精准治疗。

乳腺癌大致可分为三大类：(1)雌激素受体(ER)或孕激素受体(PR)阳性；(2)人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性，伴或不伴ER和PR阳性；(3)三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)定义为ER/PR表达缺失和HER-2无扩增的特殊类型乳腺癌[2]。TNBC主要发生在40岁以下的绝经前年轻女性中，约占所有乳腺癌患者的15%～20%。TNBC具有高度侵袭性，与其他亚型乳腺癌相比，患者生存时间较短，确诊后前5年内死亡率为40%。由于缺乏ER、PR和HER-2受体的表达，TNBC对内分泌治疗和靶向治疗均不敏感，治疗方法有限，总体治疗效果较差，探索新颖、有效的诊疗模式对于改善TNBC患者不良预后尤其重要[3]。

新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy，NAC)是局部晚期TNBC的标准治疗方案，能够达到降低临床分期、提高保乳手术率、降低术后复发风险的目的。新辅助化疗后可以根据术后病理反应制定有效的、个体化的辅助阶段治疗方案[4]。TNBC患者通过新辅助化疗取得pCR的比率高达20%～45%，显著提高了患者的无病生存率(DFS)。但临床仍有一部分患者对化疗药物不敏感，临床疗效不佳。因此，寻找可以有效预测新辅助化疗疗效的生物学标志物，筛选新辅助化疗的最适宜人群增加pCR率，对于提高TNBC患者治疗水平至关重要[5]。

在癌症代谢组学的研究中，许多氨基酸为研究发病机制提供了有价值的线索，并可作为预测多种恶性肿瘤预后的潜在指标。氨基酸很容易在血液、唾液和尿液中测量出来，可作为评估疗效的生物学标记物[6]。本次研究旨在观察化疗前、后血液中23种氨基酸水平变化情况及其与三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年3月至2021年9月于锦州医科大学附属第一医院乳腺外科行新辅助化疗的三阴型乳腺癌女性患者104例临床资料，根据2012年第4版《WHO乳腺癌组织学分类》中分级标准将纳入患者进行分级，均为II～III级的三阴型乳腺癌患者，其中II期患者53例，III期患者51例。患者年龄29～73岁；≤50岁47例，>50岁57例。绝经前52例；绝经后52 例。根据TNM分期，T17例；T266例；T321例；T410例。N07例；N169例；N223例；N35例。

1.2 纳入标准

(1)粗针穿刺活检及免疫组化检查证实为浸润性三阴型乳腺癌女性患者；(2)乳腺彩超、乳腺钼靶、乳腺磁共振检查测量初步肿瘤大小；(3)头CT、肺CT、肝胆CT、双颈部及双锁骨上淋巴结超声、妇科采色多普勒超声、全身骨显像排除远处转移；(4)患者及家属了解并同意加入本次研究；(5)初次诊断为乳腺癌，且未行放、化疗的患者；(6)新辅助化疗后行手术治疗的患者。

1.3 排除标准

(1)男性乳腺癌患者；(2)双侧乳腺癌患者；(3)临床资料不完整、既往患恶性肿瘤并行相关治疗患者；(4)化疗不能耐受者、化疗中断者、化疗后未行手术治疗者；(5)哺乳期乳腺癌患者；(6)其他类型乳腺癌患者。

1.4 方法

104例三阴型乳腺癌患者均完成TAC方案术前6周期新辅助化疗。用药方案：多西他赛 75 mg/m2，表柔比星 75 mg/m2，环磷酰胺 500 mg/m2，21 d为1个周期；化疗后均行乳腺癌改良根治术。根据术后病理评估分为：pCR组(33例)和非pCR组(71例)，分别检测两组患者化疗前以及化疗两周期后血液中23种氨基酸水平的变化情况，调查血液中氨基酸水平变化与患者新辅助化疗疗效相关性。

1.5 串联质谱检查方法

患者晨起空腹收集2 mL血样，采用干血滴(DBS)滤纸片法收集指尖血，随后，将所有样品于冰箱(4 ℃)中保存，并及时送检。用干燥的血液滤纸制成干血滴样品，立即冷冻(-80 ℃)，直到样品制备完成。用打孔器取直径3 mm圆形滤纸血片置于96孔过滤板中，每孔加入无水甲醇，置于孔板振荡器室温下震荡20 min，用孔板离心机以2000 r/min的速度离心2 min，上层样品板中的提取液通过滤膜过滤并收集于下层样品板中。离心后将下层样品板于N2保护下吹干，流动相复溶。

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，临床资料与三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效相关性比较采用χ2检验及Fisher精确概率法，化疗前、后氨基酸差异比较采用非参数检验Wilcoxon符号秩和检验，pCR组和非pCR组差异采用非参数曼-惠特尼U检验。筛选出新辅助化疗疗效有统计学意义的氨基酸水平变化及临床病理特征，并行三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效相关性的多变量Logistic分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床病理特征与三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效相关性

肿瘤T分级与三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效相关，肿瘤直径越小，越易达到pCR。年龄大小、是否闭经、淋巴结转移情况、P53、Ki67以及AR表达状态均与三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效无关，见表1。

2.2 pCR组及非pCR组化疗前、后氨基酸水平变化

pCR组化疗后谷氨酰胺、亮氨酸水平显著下降(P<0.05)；非pCR组化疗前、后谷氨酰胺、亮氨酸水平变化不明显，其他氨基酸未见明显差异，无统计学意义(P>0.05)。化疗后pCR组的谷氨酰胺和亮氨酸均显著低于非pCR组(P<0.05)，化疗前后其他氨基酸pCR组和非pCR组差异均没有统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 三阴性乳腺癌新辅助化疗疗效影响因素的多变量逻辑分析

谷氨酰胺、亮氨酸、肿瘤大小与三阴型乳腺癌新辅助化疗具有相关性，可作为新辅助化疗疗效的独立影响因素，见表3。

表1 临床病理特征与三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效的相关性

表2 氨基酸与三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效的相关性

续表

表3 影响三阴性乳腺癌新辅助化疗疗效因素的多变量逻辑分析

3 讨 论

乳腺癌是一种高度异质性疾病，不同类型乳腺癌生物学行为差异很大。TNBC占所有浸润性乳腺癌的10%～20%，由于缺乏治疗靶点，全身化疗依然是唯一能够改善不良预后的有效治疗方法。新辅助化疗是局部晚期或者较大肿瘤负荷TNBC患者的标准治疗方法。与管腔亚型相比，TNBC患者更有可能通过新辅助化疗实现pCR[7]。对比非pCR患者，能够在新辅助化疗中取得pCR的患者可能取得良好的生存获益。本研究纳入的104例行NAC治疗的TNBC患者，术后达到pCR者为33例占比31.73%，与以往相关文献所报道的数据相符。

有效的新辅助化疗疗效预测指标对于筛选出新辅助化疗的适宜人群，指导乳腺癌患者的个体化治疗具有重要意义。临床上对新辅助化疗疗效的评估主要采用彩超、核磁共振(MRI)以及肿瘤标志物等手段，然而使用彩色多普勒超声检查评估疗效受人为的主观因素影响较大，MRI检查虽然可大大提高肿瘤大小测量的准确性，但是在化疗过程中肿瘤功能与代谢变化比形态变化更早，MRI仍然无法对疗效做出准确的早期判断。以往的肿瘤标记物检测比如：CEA、CA153等等已被广泛用于乳腺癌筛查、诊断和预后预测。然而，这些标记往往缺乏足够的特异性和敏感性。评估新辅助化疗疗效亟需敏感、高特异性的生物学标志物[8]。在过去的几十年里，随着肿瘤代谢组学的快速发展，为我们寻找乳腺癌的诊断以及疗效评估的生物学标志物提供可靠的技术支持。代谢组学中对氨基酸水平的监测是了解恶性肿瘤代谢途径变化的一种全新方法。从这个意义上说，它可能成为预测抗癌药物疗效的有效工具。血浆氨基酸水平反映乳腺癌细胞对能量代谢的不同途径，包括血液中的葡萄糖、乳酸、脂质、胆碱和氨基酸指标被证明与乳腺癌的发生及发展密切相关[9]。本研究在单因素分析中，pCR组患者两周期化疗后血液中谷氨酰胺、亮氨酸水平显著下降，而Non-pCR组患者谷氨酰胺、亮氨酸水平变化不明显，化疗后pCR组的谷氨酰胺和亮氨酸均显著低于非pCR组(P<0.05)。提示血液中谷氨酰胺、亮氨酸含量变化可以作为TNBC患者接受新辅助化疗的疗效预测指标。在多因素分析中，血液中谷氨酰胺及亮氨酸含量下降、肿瘤T分级与三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效具有相关性，是影响三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效的独立影响因素，两周期新辅助化疗后血液中谷氨酰胺、亮氨酸含量降低，肿瘤T分级较小的患者更易达到pCR。

谷氨酰胺是血液中最丰富的非必需氨基酸之一，在增殖细胞的生物合成过程中都起着重要作用。作为一种信号剂，细胞外谷氨酰胺能激活转录因子STAT3以促进癌细胞增殖，细胞内谷氨酰胺也可以参与一系列肿瘤细胞信号通路过程成为非经典雷帕霉素复合物1(mTORC1)激活的重要刺激因子[10]。谷氨酰胺是癌细胞生长所必需的营养物质，乳腺癌患者血浆中谷氨酰胺水平升高[11]。在MYC过度表达的乳腺癌中(其中大多数是TNBC)显示出对谷氨酰胺高度依赖性，这可能成为TNBC患者的一个潜在治疗靶点[12]。在体内及体外实验中，亮氨酸的缺乏促进MDA-MB-231细胞凋亡进而抑制肿瘤细胞增殖能力[13]。以上研究都表明，体内谷氨酰胺与亮氨酸水平与乳腺癌的发生及发展关系密切，可能成为预测新辅助化疗疗效的生物学标志物。

综上所述，新辅助化疗两个周期后血液中谷氨酰胺、亮氨酸水平变化以及肿瘤T分级与三阴型乳腺癌新辅助化疗疗效密切相关，可作为三阴型乳腺癌新辅助化疗后能否达到pCR的独立影响因素。然而，鉴于本次研究的样本例数较少，所取得的结果仍有一定的局限性，需要今后在大量样本实验中进一步得到证实。