长链非编码RNA LINC01419调控结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移侵袭的机制

陈素华，马天江，张智慧，张磊，史磊

作者单位：漯河市中心医院肿瘤科，河南 漯河462000

结直肠癌是全球第三大恶性肿瘤，对人类健康构成重大威胁［1］。据统计，结直肠癌是所有癌症中发病率第三高的癌症［2］。结直肠癌由多种因素引起，包括个体遗传和环境影响。例如，大规模的遗传学研究发现，结直肠癌的发生与多基因异常表达和多分子相互作用有关［3-4］，但对结直肠癌发生的分子机制的研究并不详尽。因此，进一步研究结直肠癌的发病机制，可能为开发新的治疗策略提供理论依据。最新研究表明，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）LINC01419在食管鳞状细胞癌组织和细胞中上调表达，沉默其表达可抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖，促进细胞凋亡［5］。LINC01419在胃癌组织中高表达，干扰其表达抑制胃癌细胞的迁移和侵袭［6］。资料显示，微小RNA-132-3p（miR-132-3p）在结直肠癌组织和细胞中下调表达，过表达miR-132-3p 抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡［7］。但lncRNA LINC01419 在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移侵袭的影响，且lncRNA LINC01419是否通过靶向调控miR-132-3p 的表达影响结直肠癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭目前还尚未可知。因此，本研究考察lncRNA LINC01419在结直肠癌组织中的表达，以及对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移侵袭的影响，并结合miR-132-3p，探索lncRNA LINC01419潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂结直肠癌细胞株SW620 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，LINC01419 小干扰RNA si-LINC01419、si-NC、过表达质粒pcDNA、pcDNA-LINC01419、miR-NC、miR-132-3p、anti-miR-NC、anti-miR-123-3p、荧光素酶报告载体购自上海GenePharma 公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（P21）、B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白、Bcl-2 相关X（Bax）蛋白、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）抗体购自美国Cellular Signaling Technology 公司，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司。1.2 临床样本来源收集漯河市中心医院2015 年10 月至2018 年5 月因结直肠癌手术切除的组织标本20 例，以距离结直肠癌边缘≥3 cm 的癌旁正常组织标本20 例为对照。所有病例经病理学确诊为结直肠癌，术前未行任何放、化疗。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，获得病人或其近亲属的知情同意书。样本取材后迅速置于液氮中冻存，用于lncRNA LINC01419 和miR-132-3p 水平的检测。

1.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测lncRNA LINC01419 和miR-132-3p 表达结直肠癌组织和癌旁组织的总RNA 使用TRIzol 试剂获得，逆转录制备互补DNA（cDNA），以cDNA 为模板，进行qRT-PCR 反应。引物序列为：ln‑cRNA LINC01419 正 向 5´-GAAACTCCGAACA‑CATCTG-3’，反向5´-TTCTCCTGCTGGTTGATT-3´，miR-132-3p正向5´-GCGCGCGTAACAGTCTACAGG-3´，反向5´-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC-3´。ln‑cRNA LINC01419 和miR-132-3p 表达根据2−ΔΔCt方法计算。

1.4 细胞培养与转染SW620 细胞在DMEM 培养基中（含10%胎牛血清），于培养箱（37 ℃、5%二氧化碳、饱和湿润）生长。SW620 细胞转染时，将其接种至6 孔板。依照Lipofectamine 2000 试剂操作指示，在达约70% 密度时将si-LINC01419、pcDNALINC01419、miR-132-3p、anti-miR-123-3p 和各自阴性对照转染入SW620细胞，转染48 h。

1.5 MTT 法检测细胞增殖将SW620细胞接种于96 孔板（1×104个），分别培养24 h、48 h、72 h 后，与100 µL MTT 溶液反应，4 h 后将结晶用二甲基亚砜溶解，在酶标仪检测SW620 细胞的吸光度值，波长为490 nm。

1.6 蛋白质印迹法（Western blotting）检测cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9 蛋白表达利用RIPA 裂解液获得SW620 细胞的蛋白，吸取30µg 蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将其转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，经5%脱脂牛奶封闭后，4 ℃加入cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9 蛋白抗体（均为1∶1 000 稀释）孵育，次日加入二抗孵育2 h，显色、显影，以GAPDH为内参，分析蛋白条带灰度值。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡SW620 细胞（1×105个）的凋亡按照细胞凋亡检测试剂盒操作指示进行，置于流式细胞仪监测细胞凋亡情况。

1.8 Transwell 检测细胞迁移、侵袭采用无血清DMEM 培养基调整SW620 细胞密度为1×105个/毫升，并加入Transwell 上室（细胞侵袭实验时Tran‑swell 上室以Matrigel 胶包被，而细胞迁移实验未使用Matrigel 胶），下室加入500 µL 含血清的DMEM。孵育24 h后，结晶紫染色，显微镜下拍照计数。

1.9 生物信息学预测和双荧光素酶报告实验LncBasePredicted v.2 对LINC01419 和miR-132-3p的结合进行预测。构建包含miR-132-3p 结合位点的LINC01419 野生型（WT-LINC01419）和突变型（MUT-LINC01419）报告基因载体，并分别与miR-132-3p 或miR-NC 共转染SW620 细胞，48 h 后检测细胞荧光素酶活性。

1.10 统计学方法采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计处理，计量资料表示为±s。采用t检验比较两组间数据差异，采用单因素方差分析比较多组数据间差异，使用SNK 法进行组间多重比较，吸光度采用两因素析因设计方差分析，认为P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA LINC01419 和miR-132-3p 在结直肠癌组织中的表达qRT-PCR 检测数据显示，与癌旁组织比较，结直肠癌组织中lncRNA LINC01419表达量明显增加［（2.74±0.26）比（1.00±0.09），t=28.28，P<0.001］，miR-132-3p 表达量显著减少［（0.51±0.05）比（1.01±0.08），t=23.70，P<0.001］。

2.2 干扰lncRNA LINC01419 对结直肠癌细胞SW620 增殖的影响时间因素、分组因素均对吸光度有影响，且时间与分组交互条件下对吸光度仍有影响。 在结直肠癌细胞SW620 中转染si-LINC01419，其表达量明显低于si-NC 组（P<0.05）。MTT 检测结果发现，与si-NC 组比较，si-LINC01419明显降低SW620细胞24 h、48 h、72 h的细胞活性（P<0.05）。蛋白质印迹法检测结果表明，与si-NC组比较，si-LINC01419 显著减少SW620 细胞中cyclin D1和P21蛋白表达量（P<0.05）。见表1，图1。

表1 干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620增殖的影响/± s

表1 干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620增殖的影响/± s

注：cyclin D1为细胞周期蛋白D1，P21为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A。

组别si-NC si-LINC01419 t值P值P21蛋白0.23±0.03 0.61±0.06 16.99<0.001重复次数LINC01419 1.01±0.11 0.48±0.05 13.16<0.001吸光度（490 nm）48 h 0.71±0.06 0.47±0.04 9.98<0.001 24 h 0.39±0.03 0.36±0.03 2.13 0.049 72 h 1.08±0.09 0.62±0.06 12.76<0.001 cyclin D1蛋白0.72±0.06 0.32±0.03 17.89<0.001 99

图1 蛋白质印迹法检测两组结直肠癌细胞SW620增殖相关蛋白表达结果

2.3 干扰lncRNA LINC01419 对结直肠癌细胞SW620 凋亡的影响流式细胞术检测结果显示，与si-NC 组比较，si-LINC01419明显增加SW620细胞凋亡率（P<0.05）。蛋白质印迹法检测结果发现，与si-NC 组比较，si-LINC01419 显著降低SW620 细胞中Bcl-2 蛋白水平，并提高Bax 蛋白表达量（P<0.05）。见表2，图2。

表2 干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620凋亡的影响/± s

表2 干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620凋亡的影响/± s

注：Bcl-2为B细胞淋巴瘤-2，Bax为Bcl-2相关X。

组别si-NC si-LINC01419 t值P值重复次数Bax蛋白0.36±0.03 0.79±0.07 16.94<0.001 99凋亡率/%7.12±0.71 20.65±2.01 19.04<0.001 Bcl-2蛋白0.67±0.06 0.26±0.03 18.34<0.001

图2 蛋白质印迹法检测两组结直肠癌细胞SW620凋亡相关蛋白表达结果

2.4 干扰lncRNA LINC01419 对结直肠癌细胞SW620 迁移、侵袭的影响Transwell 检测结果表明，与si-NC 组比较，si-LINC01419 明显降低SW620细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数（P<0.05）。蛋白质印迹法检测结果显示，与si-NC 组比较，si-LINC01419 明显减少SW620 细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达量（P<0.05）。见表3；图3，4。

表3 干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620迁移、侵袭的影响/± s

表3 干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620迁移、侵袭的影响/± s

注：MMP-2为基质金属蛋白酶-2，MMP-9为基质金属蛋白酶-9。

组别si-NC si-LINC01419 t值P值MMP-9蛋白0.64±0.06 0.25±0.03 17.44<0.001重复次数99迁移细胞数/个106.32±10.24 49.57±5.84 14.44<0.001侵袭细胞数/个84.65±8.48 38.65±4.25 14.55<0.001 MMP-2蛋白0.81±0.07 0.39±0.03 16.54<0.001

图4 蛋白质印迹法检测两组结直肠癌细胞SW620迁移侵袭相关蛋白表达结果

2.5 miR-132-3p 过表达对结直肠癌细胞SW620 增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响时间因素、分组因素均对吸光度有影响，且时间与分组交互条件下对吸光度仍有影响。在SW620 细胞中转染miR-132-3p，发现相比于miR-NC 组，miR-132-3p 的表达量显著升高（P<0.05）。与miR-NC 组比较，miR-132-3p 对SW620 细胞24 h 的细胞活性无明显影响，明显降低48 h、72 h 的细胞活性（P<0.05），并增加细胞凋亡率（P<0.05），减少迁移细胞数和侵袭细胞数（P<0.05），以及降低cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 蛋白水平，增加P21、Bax 蛋白表达量（P<0.05）。见表4，5；图5。

表4 miR-132-3p过表达对结直肠癌细胞SW620增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响/± s

表4 miR-132-3p过表达对结直肠癌细胞SW620增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响/± s

组别miR-NC miR-132-3p t值P值重复次数吸光度（490 nm）99 miR-132-3p 1.01±0.09 2.47±0.24 17.09<0.001 24 h 0.41±0.04 0.39±0.03 1.20 0.247 48 h 0.73±0.06 0.57±0.05 6.15<0.001 72 h 1.06±0.09 0.71±0.06 9.71<0.001凋亡率/%6.58±0.66 18.46±1.84 18.23<0.001迁移细胞数/个109.47±11.25 58.97±5.32 12.17<0.001侵袭细胞数/个87.14±8.21 49.64±5.57 11.34<0.001

2.6 lncRNA LINC01419 靶向调控miR-132-3p 的表达利用LncBase Predicted v.2 工具预测发现，LINC01419的序列中含有与miR-132-3p互补的核苷酸序列。双荧光素酶报告实验结果显示，与miR-NC组比较，miR-132-3p 明显降低WT-LINC01419 荧光素酶活性［（0.41±0.04）比（1.00±0.09），t=17.97，P<0.001］，而MUT-LINC01419 荧光素酶活性的差异无统计学意义［（1.01±0.07 比1.03±0.08），t=0.56，P=0.580］。pcDNA 组、pcDNA-LINC01419 组、si-NC 组、si-LINC01419组miR-132-3p表达量比较F=294.973，P<0.001；与pcDNA 组（1.00±0.09）比较，pcDNALINC01419 明显减少miR-132-3p 表达量（0.48±0.04）；与si-NC 组（1.01±0.08）比较，si-LINC01419 显著提高miR-132-3p表达量（2.25±0.23）。

2.7 抑制miR-132-3p 表达逆转了干扰lncRNA LINC01419 对结直肠癌细胞SW620 增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用时间因素、分组因素均对吸光度有影响，且时间与分组交互条件下对吸光度仍有影响。与si-NC 组比较，si-LINC01419明显增加SW620细胞中miR-123-3p表达量、凋亡率、P21、Bax 蛋白表达量（P<0.05），对24 h的细胞活性无显著影响，而明显降低48 h、72 h 的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数以及cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 蛋白表达量（P<0.05）。与si-LINC01419 和anti-miR-NC 共转染比较，si-LINC01419 和anti-miR-123-3p 共转染显著减少SW620 细胞中miR-123-3p 表达量、凋亡率、P21、Bax蛋白表达量（P<0.05），对24 h的细胞活性无显著影响，并明显提高48 h、72 h 的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数以及cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白水平（P<0.05）。见表6，7；图6。

表5 miR-132-3p过表达对结直肠癌细胞SW620增殖、凋亡、迁移、侵袭相关蛋白表达的影响/± s

表5 miR-132-3p过表达对结直肠癌细胞SW620增殖、凋亡、迁移、侵袭相关蛋白表达的影响/± s

注：cyclin D1 为细胞周期蛋白D1，P21 为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A，Bcl-2 为B 细胞淋巴瘤-2，Bax 为Bcl-2 相关X，MMP-2 为基质金属蛋白酶-2，MMP-9为基质金属蛋白酶-9。

MMP-9蛋白0.63±0.06 0.29±0.03 15.21<0.001组别miR-NC miR-132-3p t值P值重复次数99 cyclin D1蛋白0.71±0.07 0.35±0.03 14.18<0.001 P21蛋白0.22±0.03 0.58±0.05 18.52<0.001 Bcl-2蛋白0.69±0.06 0.31±0.03 16.99<0.001 Bax蛋白0.35±0.03 0.74±0.06 17.44<0.001 MMP-2蛋白0.83±0.08 0.42±0.04 13.75<0.001

表6 抑制miR-132-3p表达逆转了干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用/± s

表6 抑制miR-132-3p表达逆转了干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用/± s

注：①与si-NC组比较，P<0.05。②与si-LINC01419+anti-miR-NC组比较，P<0.05。

组别si-NC si-LINC01419 si-LINC01419+anti-miR-NC si-LINC01419+anti-miR-123-3p F值P值侵袭细胞数/个86.32±8.24 39.68±4.12①36.77±4.01 71.25±7.01②140.95<0.001重复次数miR-123-3p 1.00±0.08 2.25±0.22①2.31±0.24 1.38±0.13②117.13<0.001吸光度（490 nm）24 h 0.40±0.04 0.37±0.03 0.36±0.03 0.38±0.03 2.44 0.082 48 h 0.74±0.06 0.51±0.05①0.46±0.04 0.62±0.06②49.35<0.001 72 h 1.07±0.09 0.66±0.06①0.61±0.06 0.92±0.08②78.58<0.001凋亡率/%7.74±0.77 22.14±2.25①24.31±2.41 13.69±1.41②157.50<0.001迁移细胞数/个108.46±9.98 51.36±5.28①48.79±5.18 88.22±8.36②135.82<0.001 9999

3 讨论

结直肠癌被认为是人类肿瘤病死率最高的肿瘤之一。在中国，结直肠癌的发病率和病死率呈上升趋势。近年来，结直肠癌的联合治疗得到了改善，包括手术切除、放疗和放化疗，然而，晚期结直肠癌病人的预后仍然很差［8］。此外，癌细胞的转移也是治疗失败的最常见原因。因此，探讨和了解结直肠癌发生发展的机制，发掘相关的诊断和预后的生物标志物，准确监测结直肠癌的发展，是一个具有特殊意义和紧迫性的问题［9］。

既往研究表明，lncRNA 在许多生物学过程中发挥着重要的作用，如肿瘤血管生成、细胞迁移、细胞凋亡和耐药性，与癌症的发生密切相关［10-11］。ln‑cRNA 可能作为致癌基因或抑癌基因在结直肠癌中发挥关键作用［12-14］。资料显示，LINC01419 在肺腺癌细胞中表达上调，敲低其表达抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，表现出对肺腺癌的致癌能力［15］。LINC01419的沉默可以有效抑制食管鳞状细胞癌的细胞增殖，并促进细胞凋亡［5］，也可抑制胃癌细胞迁移侵袭［6］。 但目前没有研究证明lncRNA LINC01419是否是参与结肠直肠癌进展的一个重要角色。本研究数据显示，LINC01419 在结直肠癌组织中表达上调，提示LINC01419 可能调控结直肠癌的发生发展。在结直肠癌SW620 细胞中转染si-LINC01419，观察到干扰lncRNA LINC01419 明显抑制SW620 细胞24 h、48 h、72 h 的细胞活性、迁移细胞数和侵袭细胞数，而提高细胞凋亡率，并且显著影响增殖、凋亡、迁移侵袭相关蛋白cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9 蛋白表达。这些结果表明，lncRNA LINC01419 在结直肠癌中可能充当致癌基因，干扰LINC01419对结直肠癌细胞增殖、迁移侵袭具有抑制作用，对细胞凋亡具有促进作用，与前人研究相符，也为其在结直肠癌中的研究提供了新的资料。

微小RNA（microRNA，miRNA/miR）是一类高度保守的非编码RNA，miRNA 已被证明参与结直肠癌等癌症的发生发展过程［16-18］。本实验数据显示，与癌旁组织比较，结直肠癌组织中miR-132-3p 表达下调，这与miR-132-3p 在膀胱癌组织中表达下调［19］的结果一致。既往研究发现，与癌旁组织相比，miR-132-3p 在乳腺癌组织中低表达，可抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭［20］，miR-132-3p 能抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡［21］。本研究功能实验结果表明，miR-132-3p 过表达可以降低结直肠癌细胞48 h、72 h 的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数，并增加细胞凋亡率，显示出抗癌活性，与Zhang 等［7］的研究一致。生物信息学结合双荧光素酶报告检测证实ln‑cRNA LINC01419 靶向调控miR-132-3p 的表达，另外，抑制miR-132-3p 表达逆转了干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620增殖、迁移、侵袭的抑制作用，以及逆转了对细胞凋亡的促进作用。上述结果证明，靶向调控miR-132-3p表达可能是ln‑cRNA LINC01419 影响结直肠癌细胞增殖、迁移侵袭、凋亡的重要途径之一。

表7 抑制miR-132-3p表达逆转了干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620增殖、凋亡、迁移、侵袭相关蛋白表达的作用/± s

表7 抑制miR-132-3p表达逆转了干扰lncRNA LINC01419对结直肠癌细胞SW620增殖、凋亡、迁移、侵袭相关蛋白表达的作用/± s

注：cyclin D1 为细胞周期蛋白D1，P21 为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A，Bcl-2 为B 细胞淋巴瘤-2，Bax 为Bcl-2 相关X，MMP-2 为基质金属蛋白酶-2，MMP-9为基质金属蛋白酶-9。①与si-NC组比较，P<0.05。②与si-LINC01419+anti-miR-NC组比较，P<0.05。

MMP-9蛋白0.65±0.06 0.23±0.03①0.22±0.03 0.54±0.05②217.22<0.001组别si-NC si-LINC01419 si-LINC01419+anti-miR-NC si-LINC01419+anti-miR-132-3p F值P值重复次数9999 cyclin D1蛋白0.73±0.07 0.31±0.03①0.29±0.03 0.61±0.06②168.12<0.001 P21蛋白0.24±0.03 0.62±0.06①0.63±0.06 0.36±0.03②150.50<0.001 Bcl-2蛋白0.68±0.06 0.27±0.03①0.26±0.03 0.56±0.05②202.44<0.001 Bax蛋白0.34±0.03 0.77±0.06①0.78±0.07 0.41±0.04②177.27<0.001 MMP-2蛋白0.84±0.07 0.38±0.03①0.37±0.04 0.71±0.06②183.82<0.001

综上所述，lncRNA LINC01419 在结直肠癌组织中表达上调，干扰其表达能抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，其作用机制与靶向调控miR-132-3p 表达有关，这对于LINC01419、miR-132-3p 在包括结直肠癌在内的诸多癌症中的治疗和预后价值研究具有极其重要的意义。

（本文图3，5，6见封三）