下调微小RNA-183表达对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞增殖凋亡的影响及机制

闫凡，黄彩虹

作者单位：榆林市第一医院小儿二科，陕西 榆林718000

肾母细胞瘤又称为Wilms 瘤，其作为一种胚胎恶性肿瘤在儿童中最为常见［1］。肾母细胞瘤的病因尚不清楚，其中基因表达改变是其发生的重要原因［2］。微小RNA（microRNA，miRNA/miR）是一种非编码的RNA，参与细胞分化、胚胎发育和疾病发生［3-4］。miR-183 是近些年来发现的肿瘤促进因子，在肺癌、膀胱癌、乳腺癌等肿瘤组织中表达上调，人为的干扰miR-183表达可以抑制肿瘤细胞的恶性表型［5-7］。现阶段对于miR-183在肾母细胞瘤细胞增殖和凋亡中的作用还不明确。本次实验于2018 年12月至2019 年7 月采用细胞转染的方法下调肾母细胞瘤SK-NEP-1 细胞中miR-183 的表达水平，探讨下调miR-183对肾母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制，以期为靶向基因治疗肾母细胞瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料肾母细胞瘤SK-NEP-1 细胞购自上海哈灵生物科技有限公司；miR-183 抑制剂（inhibitor）、抑制剂阴性对照（inhibitor control）、miR-183 模拟物（mimics）和模拟对照序列（mimics control）由吉满生物科技（上海）有限公司合成；噻唑蓝（MTT）和膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；程序性细胞死亡4（programmde cell death 4，PDCD4）抗体购自美国Abcam；引物由南京金斯瑞合成；荧光素酶报告载体由西安淳风生物科技有限公司构建；活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）抗体购自美国Sigma-Aldrich；PDCD4 小干扰RNA（si-PDCD4）、小干扰RNA 阴性序列（si-NC）购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 细胞转染采用转染试剂Lipofectamine 2000分别将miR-183 inhibitor 和inhibitor control 转染到肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞中，具体操作步骤同转染试剂说明书。设置转染miR-183 inhibitor 和inhibi‑tor control 后的肾母细胞瘤SK-NEP-1 细胞为AntimiR-183 组、Anti-NC 组，设置没有转染的细胞为对照组。

1.3 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测miR-183 表达收集培养48 h 以后的对照组、Anti-NC 组、Anti-miR-183 组细胞，然后在细胞内添加Trizol 试剂，提取细胞中总RNA。然后逆转录合成互补DNA（cDNA）。PCR 引物序列如下，miR-183 正向引物：5’-AGUGAAUUCUACCAG UGC‑CAUA 3’，反向引物：5’-UAUGGCACUGGUAGA AUUCACU3’；U6正向引物：5’CTCGCTTCGGCAGC‑CACA3’，反向引物：5’AACGCTTCACGAATTGC‑GT3’。使用SYBR Green 进行qRT-PCR，PCR 反应程序设置为：95 ℃反应2 min；95 ℃反应10 s；60 ℃反应30 s，后两步设置45个循环，U6为内参，结果用2−ΔΔCt法计算。

1.4 MTT 法测定细胞增殖能力按照对照组、An‑ti-NC 组、Anti-miR-183 组细胞分组方法将细胞种植到96 孔板中，37 ℃培养2 d，加5 g/L 的MTT，培养4 h。然后将上清吸弃，加二甲基亚砜，置于酶标仪上检测波长为490 nm的吸光度。

1.5 平板克隆实验测定细胞克隆能力把对照组、Anti-NC 组、Anti-miR-183 组细胞接种到平皿内，培养14 d，观察出现细胞克隆。以甲醇固定10 min，使用0.2%的结晶紫染色，将平皿放在倒置显微镜下计数≥50 个细胞的克隆团数目，随机选择5 个视野，计算均值。

1.6 流式细胞术测定细胞凋亡水平收集培养48 h 以后的对照组、Anti-NC 组、Anti-miR-183 组细胞，每组收集106个，将细胞悬浮在300 µL 的结合缓冲液中，将Annexin V-FITC 和PI 工作液添加到细胞中，再加入200 µL 的结合缓冲液，置于避光条件下结合反应15 min，在1 h内使用流式细胞仪测定凋亡情况。

1.7 蛋白质印迹法（Western blotting）测定细胞中cleaved-caspase-3 蛋白表达收集培养48h 以后的对照组、Anti-NC 组、Anti-miR-183 组细胞，提取细胞总蛋白。将等体积2×上样缓冲液添加到蛋白样品中，煮沸5 min。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），每孔上样30µg 蛋白，电泳2 h后关闭电源。使用转膜装置把凝胶上的蛋白电转移到NC 膜上，转膜条件为4 ℃，转膜电流为400 mA。NC 膜放在封闭液中结合1 h，将NC 膜放在cleaved-caspase-3 抗体孵育液中，在4 ℃过夜。NC膜置于二抗反应液中结合2 h。ECL发光，扫描条带灰度值，内参设置为β肌动蛋白（β-actin）。

1.8 靶基因预测和鉴定在线靶基因预测软件TargetScan 发现PDCD4 的3′非翻译区（3’UTR）端与miR-183 有互补结合位点，构建含有PDCD4 的3’UTR 端的PDCD4 野生型荧光素酶报告载体（WT），同时构建突变之后的突变型荧光素酶报告载体（MUT），利用Lipofectamine 2000 把WT 和MUT 分别与mimics control、miR-183 mimics 共转染到肾母细胞瘤SK-NEP-1 细胞中，48 h 后，用荧光素酶活性测定试剂盒检测细胞荧光素酶活性变化。

1.9 si-PDCD4 对下调miR-183 的细胞增殖、克隆和凋亡影响将Anti-miR-183 与si-NC、Anti-miR-183 与si-PDCD4 共转染到肾母细胞瘤SK-NEP-1 细胞中，记为Anti-miR-183+si-NC 组和Anti-miR-183+si-PDCD4组，参照上述MTT 法、平板克隆、流式细胞术以及蛋白质印迹法测定细胞增殖、克隆、凋亡和cleaved-caspase-3、PDCD4蛋白表达水平。

1.10 统计学方法用SPSS 21.0 软件分析数据，计量资料用±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间比较用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-183 inhibitor 抑制肾母细胞瘤细胞中miR-183 表达对照组、Anti-NC 组和Anti-miR-183组肾母细胞瘤细胞中miR-183 表达水平分别为（1.00±0.09）、（0.98±0.11）和（0.32±0.04）（F=61.82，P<0.001）。与Anti-NC 组比较，Anti-miR-183 组肾母细胞瘤细胞中miR-183 水平降低（P<0.05），对照组差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 下调miR-183 对肾母细胞瘤细胞增殖、克隆和凋亡影响与Anti-NC 组比较，Anti-miR-183 组肾母细胞瘤细胞增殖、克隆能力下降（P<0.05），细胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P<0.05）；对照组各检测指标均差异无统计学意义（P>0.05）。见图1，表1。

表1 miR-183抑制剂（inhibitor）转染后肾母细胞瘤细胞增殖能力（吸光度）、克隆形成数目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）蛋白水平变化/± s

表1 miR-183抑制剂（inhibitor）转染后肾母细胞瘤细胞增殖能力（吸光度）、克隆形成数目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）蛋白水平变化/± s

注：①与Anti-NC组比较，P<0.05。

组别对照组Anti-NC组Anti-miR-183组F值P值cleaved-caspase-3 0.28±0.03 0.27±0.04 0.69±0.09①48.76<0.001重复次数333吸光度0.39±0.05 0.40±0.03 0.20±0.02①30.08 0.001克隆形成数目/个314.58±23.85 312.87±22.28 213.69±20.94①19.97 0.002凋亡率/%2.45±0.21 2.36±0.32 16.47±1.58①224.56<0.001

图1 蛋白质印迹法检测三组肾母细胞瘤细胞cleaved-caspase-3蛋白表达

2.3 miR-183 与PDCD 靶向关系预测和鉴定在线靶基因预测软件预测的PDCD4 的3’UTR 端与miR-183 互补的结合位点见图2。共转染WTPDCD4 与miR-183 mimics 的肾母细胞瘤细胞荧光素酶活性为（0.36±0.04），显著低于共转染WTPDCD4 与mimics control 的细胞（1.00±0.12）（t=9.47，P<0.001）；共转染MUT-PDCD4 与miR-183 mimics 的肾母细胞瘤细胞荧光素酶活性为0.98±0.10，与共转染MUT-PDCD4 与mimics control 的细胞比较差异无统计学意义（1.00±0.12）（t=0.22，P=0.835），说明miR-183靶向结合PDCD4。

图2 在线靶基因预测软件TargetScan预测的程序性细胞死亡4（PDCD4）的3′非翻译区（3’UTR）端与miR-183互补的结合位点

2.4 下调miR-183 对肾母细胞瘤细胞中PDCD4 蛋白表达影响对照组、Anti-NC 组和Anti-miR-183 组肾母细胞瘤细胞中PDCD4 蛋白水平分别为（0.36±0.04）、（0.37±0.06）和（0.89±0.07）（F=81.89，P<0.001）。与Anti-NC 组比较，Anti-miR-183 组肾母细胞瘤细胞中PDCD4 蛋白水平升高（P<0.05），对照组差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

图3 蛋白质印迹法检测三组肾母细胞瘤细胞PDCD4蛋白表达

2.5 si-PDCD4 对下调miR-183 的肾母细胞瘤细胞增殖、克隆和凋亡的逆转作用与Anti-miR-183+si-NC 组比较，Anti-miR-183+si-PDCD4 组肾母细胞瘤细胞增殖和克隆能力升高，细胞凋亡减少，细胞中cleaved-caspase-3、PDCD4 蛋白表达水平下降（均P<0.05），见表2。

表2 程序性细胞死亡4（PDCD4）小干扰RNA（si-PDCD4）和miR-183抑制剂（inhibitor）共转染后肾母细胞瘤细胞增殖能力（吸光度）、克隆形成数目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）、PDCD4蛋白水平变化/± s

表2 程序性细胞死亡4（PDCD4）小干扰RNA（si-PDCD4）和miR-183抑制剂（inhibitor）共转染后肾母细胞瘤细胞增殖能力（吸光度）、克隆形成数目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）、PDCD4蛋白水平变化/± s

组别Anti-miR-183+si-NC组Anti-miR-183+si-PDCD4组t值P值重复次数33吸光度0.21±0.03 0.32±0.04 3.81 0.019克隆形成数目/个216.20±13.68 286.47±20.65 4.91 0.008凋亡率/%17.93±1.64 10.79±1.28 5.95 0.004 cleaved-caspase-3 0.72±0.08 0.30±0.03 8.51<0.001 PDCD4 0.86±0.09 0.45±0.05 6.90 0.002

3 讨论

肿瘤发生与肿瘤细胞失控性生长有关，是一个多步骤、复杂过程，在肿瘤进展中，癌基因表达上调和抑癌基因表达下调均可以诱导肿瘤恶性进展［8］。miRNA 是广泛存在于真核生物体内的单链RNA，其可以通过影响基因转录后表达而参与细胞的生长过程［9］。多项研究显示，miRNA与肿瘤的进展有关，参与调控肿瘤生长、凋亡等生物学特性发挥过程，在肿瘤进展中发挥类似癌基因或抑癌基因的作用［10-11］。miR-183在进化上高度保守，可以通过影响肿瘤相关基因的表达调控肿瘤的发展［12］。在肺癌中发现miR-183可以作为一种肿瘤促进因子诱导肺癌的生长［13］。还有研究报道，在肝癌、前列腺癌等肿瘤组织中发现miR-183 的促肿瘤生长作用，其被认为是一种肿瘤促进因子［14-15］。本次实验表明，下调miR-183后的肾母细胞瘤细胞增殖和克隆能力下降，提示下调miR-183 具有抑制肾母细胞瘤细胞恶性生长的作用。

本研究结果还显示，下调miR-183 后的肾母细胞瘤细胞凋亡水平升高，细胞中cleaved-caspase-3蛋白水平也升高。胱天蛋白酶（caspase）蛋白家族含有十几个家族成员，主要存在于细胞质中，是目前发现的与细胞凋亡有关的调控因子［16］。caspase蛋白家族成员在凋亡反应中发挥起始因子、执行因子等不同作用，并且正常情况下以酶原形式存在的caspase 蛋白家族成员不具备活性，只有被激活后才可以诱导细胞凋亡发生［17］。cleaved-caspase-3 是胱天蛋白酶-3（caspase-3）的活化形式，caspase-3 是凋亡反应的执行因子，位于凋亡级联反应的下游，其活化后是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志［18］。本次结果显示，下调miR-183 促进肾母细胞瘤细胞中cleaved-caspase-3 蛋白表达，进一步说明下调miR-183诱导肾母细胞瘤细胞凋亡。

miRNA 具有多种生物学作用，其生物学作用的发挥与调控细胞内靶基因的表达有关［19］。研究表明，miR-183 作用机制与靶向调控多个靶基因有关，并且其在不同的病理过程中调控的靶基因不同［20］。本次实验显示，PDCD4 是miR-183 的靶基因，miR-183 作用机制在肾母细胞瘤细胞中的作用机制可能与PDCD4 有关。PDCD4 是一个与细胞凋亡有关的肿瘤抑制因子，在肿瘤组织中表达下调，上调PDCD4 可以诱导肿瘤细胞凋亡和增殖抑制［21］。本研究证实，下调PDCD4 可以逆转下调miR-183 对肾母细胞瘤细胞增殖抑制和凋亡促进作用，提示下调miR-183通过靶向调控PDCD4的表达影响肾母细胞瘤细胞增殖和凋亡。

总之，下调miR-183 可以阻碍肾母细胞瘤细胞恶性生长，促进细胞凋亡，并且其作用机制与靶向调控PDCD4 的表达有关，靶向抑制miR-183 可能是肾母细胞瘤治疗的途径，miR-183 在肾母细胞瘤中可能发挥促进作用。在以后的实验中会在多株肾母细胞瘤细胞中进行验证，并对其具体的调控机制进行探讨。